Bacillus with Probiotic Function: Screening, Identification and Characterization

DONGHuixin, ZHAOLongmei, FENGMing, LIWang, LIYuanxiao, CAOPinghua, HEWanling

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Chinese Agricultural Science Bulletin ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (21) : 146-155. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0552

Bacillus with Probiotic Function: Screening, Identification and Characterization

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Abstract

The aim is to obtain the fermentation strains with remarkable ability to produce enzyme and antibacterial property, and provide reference for the conversion of new feed resources and the search for antibiotic substitutes. Using strain H14 as the starting point, its enzymatic property and antibacterial ability were analyzed. The feed addition and fermentation time of fermented rapeseed meal were optimized by single factor experiments. A strain of Bacillus cereus H14 that produces cellulase, protease, amylase, and xylanase was screened and identified. The optimal reaction conditions for cellulase production were 60℃ and pH 9, and the activity of cellulase, protease, amylase and xylanase was 11.51 U/mL, 73.68 U/mL, 5.96 U/mL and 14.02 U/mL respectively. The maximum inhibitory diameters against Escherichia coli and Staphylococcus aureus were 18.200±0.200 mm and 17.567±0.493 mm, respectively. The optimal conditions for fermenting rapeseed meal to produce cellulase were adding 25% rapeseed, incubating for 48 h, enzyme activity reached 12.608 U/mL, and the optimal antibacterial effects on Escherichia coli and Staphylococcus aureus were adding 25% rapeseed meal and incubating for 48 h, the antibacterial diameter (mm) was 24.933±0.204; and adding 25% rapeseed meal and incubating for 72 h, the antibacterial diameter (mm) was 27.400±0.529, respectively. The fermentation products contain sucrose, xylose, and glucose. This experiment screened out a good fermentation strain, which could provide some reference for the development of fermented feed.

Key words

Bacillus cereus / screening and identification, enzymatic characteristic analysis / fermented rapeseed meal / antibacterial property / fermentation strain / cellulase / protease / amylase / xylanase / conversion of feed resources / alternative to antibiotics

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DONG Huixin , ZHAO Longmei , FENG Ming , LI Wang , LI Yuanxiao , CAO Pinghua , HE Wanling. Bacillus with Probiotic Function: Screening, Identification and Characterization. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2024, 40(21): 146-155 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0552

0 引言

‘金叶’锦带为从美国引入的优良彩叶园林树种。国内环境条件、土壤有机质和各种速效养分含量与原产地存在差异,导致其生长季节长势弱,抗逆性差,品种特异性表达不明显[1],因此,试验拟采取人工施肥的方式改善土壤营养状况,提高其抗逆性,以适应本地环境条件,为园林中推广应用提供参考。‘金叶’锦带对城市环境具有较强的适应性,对丰富国内北方城市园林彩叶树种种类具有重要的作用[2]。树木生长季节追肥可以显著促进植株生长[3],也可以提高树木育苗成苗率,对培育优质壮苗具有显著作用[4]。钾元素被称为抗逆元素,施用钾肥可以明显提高植物抗逆性[5],并且在彩叶植物养护中,钾营养也是必需营养元素,其对彩叶树种品种特异性的表达具有重要作用[6]。张义[7]研究认为,适宜的钾肥施用量可以显著促进红叶李生长和光合作用提高,对提高叶片内可溶性糖含量具有显著效果,并可以提高红叶李对当地环境条件的适应性。何学燕[8]研究认为,氮磷钾配合施用对促进香榧幼苗生长效果显著优于单纯施用氮肥或者氮钾肥。尹燕萍[9]研究认为,氮磷钾配合施用对改善银杏生理特性效果优于氮钾2种营养元素组合,这可能与磷元素同样可以提高植物抗逆性,以适应不良环境条件,并改善植物生理特性有关[10,11]。速效有机肥养分含量丰富,可以提高土壤内有机质含量,改善土壤物理结构,促进植物健壮生长[12,13],并能提高植物对不良环境的适应能力,也可以提高引种植物的适应性[14]。张吉立[15]研究认为,有机肥在施用初期对植物叶绿素提高的促进作用不明显,但是肥效较长,后期促进作用比较显著。胡学木[16]研究认为,有机肥可以改善番茄生理特性,显著提高抗逆性,对降低基腐病、青枯病等病害具有显著效果。从前人的相关研究来看,关于不同施肥处理对‘金叶’锦带抗逆生理的研究鲜见相关报道。笔者通过详细研究不同施肥处理对‘金叶’锦带生理特性的影响规律,明确显著提高‘金叶’锦带各项抗逆生理指标的施肥处理,以期为‘金叶’锦带在推广应用中科学合理进行施肥养护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

田间试验于2018年4—10月在山西省林木育种研究中心试验田内进行。‘金叶’锦带各项生理指标的测定均在生理生化实验室内进行,测定时间为每次田间取样后的第2天。

1.2 试验材料

试验所选‘金叶’锦带为4年生苗,2014年4月在育苗床中用扦插的方式繁殖,2016年3月15日移栽入苗圃内,栽培密度40 cm×40 cm。生长季节内,‘金叶’锦带未遭受干旱和水涝危害。试验所选苗木原从河北定州燕青园艺中心引入,部分植株在2016年7—8月间发生了轻微的白粉病,2017年6—7月光照比较强烈的中午幼嫩叶片发生轻微萎蔫,抗逆性较差。试验地土壤肥力情况为有机质含量9.66 mg/g,碱解氮为27.33 μg/g,P2O5为8.13 μg/g,K2O为55.78 μg/g。试验所用有机肥（发酵饼肥）生产厂家为山西省霍州市兴佳肥料有限公司,2017年11月出厂,含氮量为2.30%,P2O5含量为1.20%,K2O含量为2.46%,有机质含量为323.00 g/kg。

1.3 试验设计

试验共设计4个处理,T1为对照,不施用任何肥料;T2为当地常规彩叶植物施肥（化肥氮钾组合）处理,施肥量为纯氮2.10 g/株,K2O为4.50 g/株;T3为改良后彩叶树种施肥（化肥氮磷钾组合）处理,施肥量为纯氮2.10 g/株,P2O5为2.25 g/株,K2O为4.50 g/株;T4为建议施肥（有机无机肥配合）处理,由化学肥料和有机肥（发酵饼肥）配合施用,施肥量为纯氮2.10 g/株,P2O5为2.25 g/株,K2O为4.50 g/株。各处理的具体肥料施用配比见表1。小区试验设计,每处理40株,3次重复。按照试验设计的施肥种类以及施肥量称量好后,于3月20日在距离‘金叶’锦带根茎15 cm处开挖10 cm深、10 cm宽的环状沟,将肥料与土壤按照1:2比例混合均匀后施入沟内,然后覆土,浇透水1次。试验所选氮肥为尿素,含氮量46%,磷肥为重过磷酸钙,P2O5含量为46%,钾肥为硫酸钾,K2O含量为50%。试验期间,在3月20日、6月20日、8月23日浇水,7月13日、8月10日除草。
表1 各试验处理施肥量设计 g/株
处理 尿素 重过磷酸钙 硫酸钾 发酵饼肥
T1 0 0 0 0
T2 4.56 0 9.00 0
T3 4.56 4.89 9.00 0
T4 0 2.50 4.50 91.46

1.4 试验测定项目

分别于5—9月每个月的14日到田间取样,每处理选择10株‘金叶’锦带,按照树冠上、中、下3个部位取样,每个部位取叶片3片,取样后装入封口袋中并贮存于放有冰块的保温箱中,带回实验室冲洗干净后剪碎,混合均匀后进行相关指标的测定。其中可溶性糖含量测定采用蒽酮法[17],脯氨酸含量测定采用茚三酮法[17],CAT活性测定采用紫外光吸收法[17],SOD活性测定采用NBT还原法[17],叶绿素含量采用浸提法[18],MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[17]。每项指标测定6次,取平均值作为最终结果。

1.5 试验仪器以及试剂

试验所选分光光度计型号为723N型,由上海光化学仪器一厂生产,2014年10月购入;紫外光分光光度计型号为2102C型,由尤尼柯（上海）仪器有限公司生产,2016年9月购入;尿素由山西东升肥业有限公司生产;硫酸钾为运城市田乐肥业有限公司生产;茚三酮由上海芃硕生物科技有限公司生产,2017年8月购入;硫代巴比妥酸由上海源叶生物科技有限公司生产,2017年8月购入。

1.6 数据分析

数据分析以及图表制作使用Excel 2013版软件,方差分析使用DPS 7.05软件。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对‘金叶’锦带可溶性糖含量的影响

由图1可知,不同施肥处理对‘金叶’锦带各月份可溶性糖含量的影响存在差异。5月,T3处于最高值,T4低于T3处理1.42 mg/g,无显著差异,表明T4与T3相比在5月降低了可溶性糖含量,但效果不显著;T2低于T4处理0.78 mg/g,无显著差异,表明T2与T4对可溶性糖含量的影响处于同一水平;T4高于T1处理2.40 mg/g,差异显著,T3显著高于T1,表明与对照相比,T3、T4在5月均可以显著提高‘金叶’锦带可溶性糖含量。6—9月,T4分别高于T3处理3.55、5.80、4.67、4.32 mg/g,差异显著,表明T4与T3相比可以显著促进‘金叶’锦带可溶性糖含量提高;T4分别高于T2处理5.52、10.07、7.67、7.70 mg/g,差异显著,表明T4与T2相比可以显著提高‘金叶’锦带可溶性糖含量;T4分别高于对照7.28、12.98、9.97、10.48 mg/g,差异显著,表明T4与对照相比对提高可溶性糖含量效果显著。7、9月,T3分别高于T2处理4.27、3.38 mg/g,差异显著,表明T3与T2相比在7、9月对促进可溶性糖含量升高效果显著,T2分别高于对照2.91、2.78 mg/g,差异显著,表明T2与对照相比在7、9月可以显著促进‘金叶’锦带可溶性糖含量升高。
图1 不同施肥处理对‘金叶’锦带可溶性糖含量的影响
图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同

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2.2 不同施肥处理对‘金叶’锦带脯氨酸含量的影响

由图2可知,不同施肥处理对‘金叶’锦带脯氨酸含量的影响存在差异。5—6月,T3处于最高值,分别高于T4处理7.88、13.66 μg/g,差异显著,表明T4与T3相比在5—6月会显著降低脯氨酸含量;T4分别高于对照12.20、12.25 μg/g,差异显著,表明与对照相比5—6月T4可以显著提高‘金叶’锦带脯氨酸含量;T2在5月低于T4处理7.73 μg/g,差异显著,表明T4与T2相比在5月对促进脯氨酸含量升高效果显著。7—9月,T4脯氨酸含量处于最高值,分别高于对照23.32、29.33、32.78 μg/g,差异显著,表明T4与对照相比可以显著促进脯氨酸含量升高;T4分别高于T3处理7.99、12.53、13.67 μg/g,差异显著,表明与T3相比,7—9月T4对促进脯氨酸含量升高效果显著;T4分别较T2提高了16.10、21.21、22.85 μg/g,差异显著,表明T4与T2相比对提高脯氨酸含量升高效果显著。7—9月T3分别高于T2处理8.11、8.68、9.18 μg/g,差异显著,表明T3与T2相比对提高脯氨酸含量效果显著;7、9月T2分别高于对照7.23、9.93 μg/g,差异显著,表明T2与对照相比在这2个月可以显著促进脯氨酸含量升高。
图2 不同施肥处理对‘金叶’锦带脯氨酸含量的影响

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2.3 不同施肥处理对‘金叶’锦带CAT活性的影响

由图3可知,不同施肥处理在不同月份对‘金叶’锦带CAT活性的影响存在差异。5月,T3高于T4处理1.53 U/g,无显著差异,表明T4与T3相比在5月降低了CAT活性,但效果不显著;T4高于T2处理2.55 U/g,无显著差异,表明T4与T2相比不会对CAT活性产生显著影响;T4高于对照5.08 U/g,差异显著,表明与对照相比T4对提高CAT活性效果显著。6—9月,T4分别高于T3处理4.75、7.70、8.80、10.49 U/g,差异显著,表明T4与T3相比,在6—9月对提高‘金叶’锦带CAT活性效果显著;T4分别高于T2处理7.47、12.77、16.02、16.79 U/g,差异显著,表明T4与T2相比显著促进了CAT活性升高;T4分别高于对照10.75、18.78、21.13、21.71 U/g,差异显著,表明与对照相比,T4可以显著促进‘金叶’锦带CAT活性升高。5—7月,T3分别高于T2处理4.08、2.72、5.07 U/g,无显著差异,表明与T2相比,T3在这3个月份可以提高CAT活性,但效果不显著,8—9月,T3分别高于T2处理7.22、6.30 U/g,差异显著,表明T3与T2相比,在8—9月可以显著提高CAT活性。6—9月,T2分别高于T1处理3.28、6.01、5.11、4.92 U/g,差异显著,表明在6—8月T2与对照相比对提高CAT活性效果显著。
图3 不同施肥处理对‘金叶’锦带CAT活性的影响

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2.4 不同施肥处理对‘金叶’锦带SOD活性的影响

由图4可知,不同施肥处理在不同月份对‘金叶’锦带SOD活性的影响存在差异。5月,T4低于T3处理4.21 U/g,差异显著,表明在5月T4与T3相比会显著降低SOD活性;T4低于T2处理1.24 U/g,无显著差异,表明在5月T2与T4对SOD活性的影响处于同一水平;T4高于对照1.85 U/g,差异显著,表明T4与对照相比对提高SOD活性效果显著。6—9月,T4分别高于T3处理1.86、7.25、8.99、12.31 U/g,其中6月无显著差异,7—9月差异显著,表明在6月T4与T3相比可以提高SOD活性,但效果不显著,7—9月提高效果达到显著水平;T4分别高于T2处理6.28、12.70、14.02、16.33 U/g,差异显著,表明T4与T2相比,在6—9月可以显著提高‘金叶’锦带SOD活性;T4分别高于对照11.15、16.35、19.10、21.32 U/g,差异显著,表明与对照相比T4对提高‘金叶’锦带SOD活性效果显著。6—9月,T3分别高于T2处理4.42、5.45、5.03、4.02 U/g,无显著差异,表明T3与T2相比可以提高‘金叶’锦带SOD活性,但是效果不显著;T3分别高于对照80.85%、55.73%、51.43%、48.83%,差异显著,表明与对照相比T3可以显著促进‘金叶’锦带SOD活性升高;T2与对照相比在6—9月差异显著,表明T3在6—9月也可显著促进SOD活性升高。
图4 不同施肥处理对‘金叶’锦带SOD活性的影响

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2.5 不同施肥处理对‘金叶’锦带叶绿素含量的影响

由图5可知,叶绿素含量在不同月份因施肥处理的不同而存在差异。5—6月,T3处于最高值,分别高于T4处理0.16、0.11 mg/g,无显著差异,表明T4与T3相比降低了叶绿素含量,但效果不显著;5月T4低于T2处理0.07 mg/g,6月T4高于T2处理0.13 mg/g,2个处理之间无显著差异,表明T4与T2相比在5—6月对‘金叶’锦带叶绿素含量的影响处于同一水平;T4分别高于对照0.06、0.28 mg/g,其中5月差异不显著,6月差异显著;T2在5—6月均与对照之间存在显著差异。7—8月T4处于最高值,分别高于T3处理0.25、0.27 mg/g,无显著差异,表明T4与T3相比在7—8月会提高叶绿素含量,但是效果不显著;T4分别高于T2处理0.42、0.53 mg/g,差异显著,表明与T2相比,T4在7—8月对促进叶片内叶绿素含量升高效果显著;T4分别高于对照0.71、0.82 mg/g,差异显著,表明T4与对照相比在7—8月可以显著提高叶绿素含量;T2、T3均显著高于对照,表明这2个处理在7—8月可以显著促进叶绿素含量升高。9月T4高于对照0.14 mg/g,无显著差异,表明在9月与对照相比T4可以提高叶片内叶绿素含量,但是效果不显著;T4分别高于T2、T3处理0.53、0.27 mg/g,差异显著,表明T4与T2、T3相比,在9月对提高叶绿素含量效果显著。
图5 不同施肥处理对‘金叶’锦带叶绿素含量的影响

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2.6 不同施肥处理对‘金叶’锦带MDA含量的影响

由图6可知,不同施肥处理在不同月份对‘金叶’锦带MDA含量的影响存在差异。5月,T4低于对照0.58 μmol/g,无显著差异,表明T4与对照相比降低了MDA含量,但是效果不显著;T4高于T2处理1.20 μmol/g,无显著差异,表明T2、T4在5月对MDA含量的影响处于同一水平;T4高于T3处理2.52 μmol/g,差异显著,表明在5月T3与T4相比,T3对降低MDA含量效果显著优于T4;6月,T4低于T2处理0.90 μmol/g,T4高于T3处理1.34 μmol/g,T2、T3、T4之间无显著差异,表明在6月各施肥处理对MDA含量的影响处于同一水平;T4低于对照3.88 μmol/g,差异显著,T2、T3均显著低于对照,表明与对照相比,6月T2、T3、T4均可以显著降低MDA含量。7—9月,T4分别低于对照8.26、11.52、14.33 μmol/g,差异显著,表明在这3个月份,T4与对照相比对降低MDA含量效果显著;T4分别低于T3处理2.60、3.52、6.02 μmol/g,7月无显著差异,8、9月差异显著,表明6月T4与T3相比降低了MDA含量,但是效果不显著,8—9月达到显著水平;T4分别低于T2处理4.36、7.28、11.11 μmol/g,差异显著,表明T4与T2相比在7—9月可以显著降低‘金叶’锦带叶片内MDA含量。
图6 不同施肥处理对‘金叶’锦带MDA含量的影响

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3 结论

（1）与对照相比,T2在7、9月可以显著提高‘金叶’锦带可溶性糖和脯氨酸含量;与T2相比,T3在6月和8月对促进可溶性糖含量效果不显著、7月和9月显著,7—9月T3对提高脯氨酸含量效果显著;与T3相比,6—9月T4对促进可溶性糖含量升高效果显著,7—9月显著促进了脯氨酸含量升高。
（2）与对照相比,6—9月T2显著促进了CAT和SOD活性升高;与T2相比,6—7月T3提高了CAT活性,效果不显著,8—9月达到显著水平,6—9月T3提高了SOD活性,效果不显著;与T3相比,6—9月T4显著提高了CAT、SOD活性。
（3）与对照相比,T2在5—8月显著提高了叶绿素含量,6—8月显著降低了MDA含量;与T2相比,5—7月T3提高了叶绿素含量,效果不显著,8—9月达到了差异显著水平,5—8月T3降低了MDA含量,效果不显著;与T3相比,5—8月T4对叶绿素含量的影响效果不显著,6—7月降低了MDA含量,但效果不明显,8—9月达到了显著水平。
（4）综合分析认为,T4对改善‘金叶’锦带生理特性效果显著优于T2、T3处理。

4 讨论

‘金叶’锦带具有较高的观赏价值,目前在部分城市的引种和园林应用中取得了一定的成效[19],但是由于不同地区环境条件的差异,‘金叶’锦带后期施肥、修剪、病虫害防治的配套技术研究目前还相对比较少,所以加强‘金叶’锦带在城市环境条件下配套施肥技术和养护技术的研究将是未来重要的研究方向。在各种养护技术中,施肥技术是保持树木健壮生长和提高适应性的重要技术手段[20]。‘金叶’锦带属于彩叶树种,而在部分彩叶树种养护中,氮钾肥配合施用一定程度上可以使彩叶植物的品种特性较好地表达,对于增添园林景观色彩具有显著作用[21]。从本试验结果看,氮钾2种营养元素一定程度上可以改善‘金叶’锦带生理特性,但是效果不明显,表明单纯施用氮钾营养元素对‘金叶’锦带而言,并非最优施肥处理;在氮钾营养元素基础上增加磷元素后,与单纯氮钾营养元素处理相比提高了可溶性糖、脯氨酸、叶绿素含量,提高了保护酶活性,表明在原有施肥基础上增加磷元素后对改善‘金叶’锦带营养状况和协调生理特性具有重要作用,这与刘振平[22]在紫叶矮樱上的研究结果相似,说明氮磷钾营养元素的配合施用更加有利于‘金叶’锦带营养条件的改善。从本试验地土壤肥力状况看,有机质含量和速效养分含量较低,单纯施用化学肥料会导致生长季节后期养分不足[23],因此为保证整个生长季节养分供应平衡,施肥中添加一定比例的有机肥是较好的施肥方式[24]。从本试验结果看,在3个施肥处理中,添加有机肥（发酵饼肥）处理的可溶性糖、脯氨酸、叶绿素含量、保护酶活性在生育后期均显著优于单纯施用化学肥料处理,这与陈修斌[25]的研究结果相似,表明有机肥对改善植物营养状况和生理特性具有较好的作用。从MDA含量的变化上看,各施肥处理降低了‘金叶’锦带MDA含量,这与胡映泉[26]在扶芳藤上的研究结果相似,不同处理比较看,T4处理明显优于其他3个处理,表明在试验地条件下,T4为‘金叶’锦带适宜的施肥处理。本试验选用的有机肥为发酵饼肥,是一种速效性有机肥,与缓效态有机肥相比在施用当季养分释放量较高,对改善‘金叶’锦带营养状况具有显著作用。从有机肥的施用现状看,缓效态有机肥在市场上仍然占据一定的份额,所以研究缓效态有机肥对‘金叶’锦带生理特性的影响规律也是未来研究的重要方向。本项研究中尚未比较和分析发酵饼肥与缓效态有机肥（如厩肥）对‘金叶’锦带生理特性的影响规律,所以在后续的相关研究中,分析不同种类的有机肥对‘金叶’锦带生理特性的影响规律以及对土壤肥力和质地的影响规律将是另一个研究方向。本项研究所选速效有机肥是为实现快速改善土壤肥力情况和改善化学肥料肥效较短的不足而提出的解决方法,以使‘金叶’锦带栽植后快速改善营养状况,提高其适应性,充分表达品种固有特性,这也是本项试验研究的亮点所在。

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