Differential Analysis of Organic Acids in Different Origins of Raspberry based on HPLC Combined with Multivariate Statistical Methods

LV Bolong, LI Guozhu

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Chinese Agricultural Science Bulletin ›› 2023, Vol. 39 ›› Issue (29) : 129-136. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0360

Differential Analysis of Organic Acids in Different Origins of Raspberry based on HPLC Combined with Multivariate Statistical Methods

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Abstract

To investigate the differences of eight organic acids in raspberry from different origins, a method for measuring the content of eight organic acids at the same time by HPLC was established, in order to provide a theoretical basis for some sour substances in raspberry. The raspberry herb of the same harvesting period was taken as the research object, the quantitative methods of eight organic acid components were established by HPLC, and the differences were analyzed and compared by cluster analysis (CA), principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA). The results showed that the linear relationship of organic acids in the concentration range of 0.001-2.00 mg/mL was good, the limit of detection (LOD) were 0.326~1.114 μg/mL, the limit of quantification (LOQ) were 1.060~3.604 μg/mL, the average recovery rates were 97.40%-101.58%, and the relative standard deviation (RSD) were 1.23%-2.34%. This method determines the content of organic acids in raspberry of different origins, both cluster analysis and OPLS-DA can effectively distinguish some production areas according to provinces, and the effect of OPLS-DA is better than CA, the origins can be clustered into 7 categories according to the province: Zhejiang, Anhui, Jiangsu, Fujian, Jiangxi, Sichuan and Hunan. The PCA results showed that oxalic acid, tartaric acid, malic acid, shikimic acid, citric acid, succinic acid, and acetic acid were the main organic acids in raspberry herbs. HPLC was established to analyze the differences on the content of eight organic acids in raspberry at the first time, and the origins are wide, the results are reliable, which could be used for the quality evaluation and preliminary differentiation of organic acid components in raspberry of different origins.

Key words

raspberry / different origins / multivariate statistics / organic acids / HPLC

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LV Bolong , LI Guozhu. Differential Analysis of Organic Acids in Different Origins of Raspberry based on HPLC Combined with Multivariate Statistical Methods. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2023, 39(29): 129-136 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0360

0 引言

覆盆子为始载于《名医别录》,收载于《中国药典》2020版[1]和《中华药典》[2]的药食两用果实,为蔷薇科植物掌叶覆盆子(又名华东覆盆子)Rubus chingii Hu的干燥未成熟果实,味甘、酸,具有益肾固精缩尿,养肝明目的功效[3],用于遗精滑精,遗尿尿频,阳痿早泄,目暗昏花。该药材应以灰绿色和黄绿色为主,红棕色通常为近成熟果实,易霉变或变质,且会通过化学成分的改变进而影响疗效[4]。目前覆盆子主要分布为浙江、四川、安徽、福建、江苏、四川、广西、湖南等省份[5]。现代研究表明,覆盆子含有多种生物活性成分,主要是萜类、黄酮类和有机酸类,具有抗补体、抗癌、抗氧化和抗炎等功能[6]。果实类药材富含多种有机酸,传统中医五味理论认为“酸收敛”“酸入肝”,有机酸被认为是中药“酸”性的标志性物质[7]。覆盆子中的有机酸以酚酸居多,如覆盆子酸、鞣花酸、水杨酸等[8],其次是脂肪酸,包括苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸、琥珀酸等[9]。覆盆子的有机酸研究相对较少,超过6种有机酸的同时检测更鲜未报道。目前测定有机酸的方法主要有分光光度法[10]、电位滴定法[11]、离子色谱法[12-13]、气相色谱法[14]、液相色谱法[15-16]以及液相色谱-串联质谱法[15]等。分光光度法和电位滴定法多用于总有机酸含量测定,气相色谱法则需要对有机酸进行酯化衍生,步骤繁琐且易引入外源杂质;液相色谱-串联质谱结果更精确,但成本高[17]。液相色谱法则可操作性强,可同时检测数十种有机酸。高效液相色谱法应用于覆盆子有机酸的含量检测也有报道[18],但已有的报道检测的有机酸种类不多,同时对产地的研究有限。
本研究采用高效液相色谱法同时测定具有生物活性的8种果实中常见的水溶性有机酸[19-20]:草酸(Oxalic acid,OA)、苹果酸(Malic acid,MA)、酒石酸(Tartaric acid,TA)、柠檬酸(citric acid,CA)、莽草酸(Shikimic acid,SA)、乙酸(Acetic acid)、富马酸(fumaric acid,FA)、琥珀酸(Amber acid,AA),对不同产地覆盆子药材中的有机酸含量进行测定,运用聚类分析(clusteranalysis,CA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partialleast squares-discrimination analysis,OPLS-DA)将药材进行分类和分析差异。本研究在前人研究基础上,综合了覆盆子可能检测到的8种有机酸,以期建立一种果实类药材通用的有机酸同步快速HPLC检测方法,并结合多元统计分析,为不同产地覆盆子药材分类判别和明确各有机酸成分提供理论依据,进一步为该药材的质量控制及其药材品质评价标准研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2021年收集了同一采收期来自于8省30个产地的覆盆子药材样品。样品经李国柱鉴定为华东覆盆子Rubus chingii Hu药材。覆盆子药材的样品信息见表1
表1 覆盆子药材产地及批号
编号 产地 批号 编号 产地 批号 编号 产地 批号
1 江西婺源 20210522 11 安徽巢湖 20210520 21 福建南平 20210522
2 江西横峰 20210524 12 浙江千岛湖 20210518 22 福建大田 20210522
3 江西德兴 20210522 13 浙江衢州 20210523 23 福建政和 20210522
4 江西玉山 20210519 14 浙江三门 20210522 24 福建霞浦 20210522
5 安徽亳州 20210520 15 浙江兰溪 20210522 25 四川绵阳 20210520
6 安徽绩溪 20210428 16 浙江文成 20210522 26 四川广元 20210520
7 安徽歙县 20210525 17 浙江台州 20210522 27 江苏江阴 20210524
8 安徽广德 20210521 18 浙江宁波 20210522 28 江苏昆山 20210524
9 安徽泾县 20210521 19 浙江馨昌 20210522 29 广西柳州 20210522
10 安徽黄山 20210521 20 湖南衡阳 20210523 30 广西玉林 20210522
有机酸标准品草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、莽草酸标准品(≥99.0%)均购买于上海源叶生物科技有限公司。甲醇(色谱纯)购买于赛默飞科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 覆盆子药材的有机酸提取

有机酸的提取参照刘慧等[21]的方法但略有改动。准确称取覆盆子药材适量,粉碎过40目筛。精密称取1.0 g,用60%乙醇超声提取30 min,固液比1:10,提取2次,离心合并上清液,旋蒸浓缩至干。用超纯水复溶定容至10 mL,用 0.22 μm的水系滤膜过滤到小棕瓶中上机检测。

1.2.2 标准溶液的配制

精密称取有机酸标准品,将草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、莽草酸用超纯水配制成浓度均为2.00 mg/mL的母液,再逐级稀释成系列浓度的混合对照品溶液。标样经0.22 μm微孔滤膜过滤后,样品瓶中保存备用。

1.3 色谱条件

高效液相色谱(岛津)LC-2030C,检测器:PDA检测器。Cosmosil 5PAQ-C18色谱柱(4.6mm×250mm, 5 μm);流动相:A相为甲醇,B相为0.075%三氟乙酸水溶液(pH=3),2%A等度洗脱;流速:0.8 mL/min;柱温:45℃;进样量:10 μL;检测波长:210 nm。

1.4 数据处理

采用SPSS进行数据处理,采用Origin 2021软件绘制热图,采用SIMCA14.1绘制OPLS-DA分析图。

2 结果与分析

2.1 HPLC条件优化及线性相关分析

试验对比了不同比例的流动相(甲醇:0.075%三氟乙酸),包括0:100,2:98,5:95。取上述系列浓度的混合标准品溶液,按照1.3的条件依次进样测定,结果表明当水相占比2%时,8种有机酸在10 min内全部出峰,除草酸和酒石酸分离度略大于1.0,其余6种有机酸的分离度均大于1.5(见图1)。同时对比了0.6、0.8、1.0 mL/min不同流速和25、30、40℃不同柱温对组分峰分离的影响,结果发现降低流速,出峰时间变长,峰形变宽,提升温度,峰形变窄,基线更平稳。同时用水作为空白溶剂在1.3项色谱条件下结果表明无干扰,系统适用性良好。
图1 8种有机酸对照品色谱图
1.草酸;2.酒石酸;3.苹果酸;4.莽草酸;5.乙酸;6.柠檬酸;7.琥珀酸;8.富马酸

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将浓度范围为0.001~2.00 mg/mL的8种有机酸标准品进行HPLC分析,根据峰面积(y)和质量浓度(x)得到8种有机酸的标准曲线方程。将标准溶液适当稀释后进样分析,以信噪比10:1作为定量限,以信噪比3:1作为检测限。结果见表2
表2 8种有机酸标样的标准曲线方程、检测限和定量限
有机酸组分 保留时间/min 标准曲线 相关系数r 检测限/(μg/mL) 定量限/(μg/mL)
草酸 3.212 y=5000000x-4814.9 0.99995 0.645 2.080
酒石酸 3.546 y=912187x+5323.2 0.99990 1.114 3.604
苹果酸 3.987 y=795565x-5800.1 0.99975 0.326 1.060
莽草酸 4.254 y=20000000x+72306 0.99999 0.579 1.730
柠檬酸 4.699 y=790177x+8447.6 0.99990 0.401 1.209
乙酸 5.616 y=479104x-2922.7 0.99999 0.682 2.060
琥珀酸 5.981 y=464210x+4213.5 0.99985 0.558 1.601
富马酸 8.033 y=9000000x+7577.4 0.99990 0.502 1.500

2.2 方法学验证

2.2.1 精密度试验

分别精密吸取同一浓度的混标溶液在HPLC上进行分析,连续进样6次,结果混标溶液中各有机酸的峰面积RSD为0.11%~2.14%,表明仪器精密性优。

2.2.2 重复性试验

分别精密称取同一覆盆子药材粉末6份,制备待HPLC分析的样品溶液进行检测,结果表明供试品样品中8种有机酸的峰面积RSD为0.18%~3.23%,表明方法的重复性优良。

2.2.3 稳定性试验

分别精密称取同一覆盆子药材粉末1.0 g,制备待HPLC分析的样品溶液,每2 h进样一次,共测定48 h,结果表明供试品溶液中8种有机酸的峰面积RSD为0.21%~3.47%,表明供试品溶液在48 h内稳定性优良。

2.2.4 样品回收率试验

精密称取覆盆子药材粉末1.0 g,6份,分别加入适量标准品溶液,按1.2.1项下方法制备样品溶液,进样检测,计算各有机酸成分的加样回收率和RSD,结果见表3。结果均符合相关要求。
表3 8种有机酸的回收率和相对标准偏差 SRSDn=6
有机酸组分 2.0 μg/mL 100 μg/mL 1000 μg/mL
回收率% SRSD/% 回收率% SRSD/% 回收率% SRSD/%
草酸 101.2 1.24 99.01 2.11 98.61 1.68
酒石酸 98.29 1.58 97.59 1.24 99.90 1.33
苹果酸 98.45 1.73 99.64 1.49 98.41 1.28
莽草酸 98.90 1.47 100.81 1.45 101.58 1.23
柠檬酸 99.38 1.62 99.17 1.38 97.4 1.31
乙酸 100.42 1.49 98.74 1.32 101.02 1.43
琥珀酸 99.99 1.95 102.50 1.55 99.90 1.26
富马酸 99.83 2.22 98.26 1.46 100.26 2.34

2.3 不同产地覆盆子中8种有机酸含量测定

精密吸取供试品溶液10 μL,按1.3项下的色谱条件进样(n=3),色谱图如图2所示,计算不同产地覆盆子中不同有机酸的含量(表4)。
图2 30个产地的覆盆子样品色谱图

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表4 不同产地覆盆子中8种有机酸含量测定结果 mg/g,n=3
产地 缩写 草酸 酒石酸 苹果酸 莽草酸 乙酸 柠檬酸 琥珀酸 富马酸
江西婺源 JXWY 1.089 2.319 1.669 0.052 0.702 3.226 2.16 0.004
江西横峰 JXHF 1.02 2.891 1.396 0.014 0.257 3.860 2.025 0.009
江西德兴 JXDX 1.054 2.605 1.533 0.033 0.480 3.543 2.092 0.006
江西玉山 JXYS 1.064 2.485 1.439 0.028 0.680 2.586 2.143 0.002
安徽亳州 AHBZ 1.405 1.731 2.177 0.098 0.565 3.122 2.714 0.002
安徽绩溪 AHJX 1.499 1.645 2.332 0.122 0.305 2.505 3.038 0.003
安徽歙县 AHSX 1.485 1.703 2.311 0.106 0.365 3.625 2.572 0.009
安徽广德 AHGD 1.491 1.684 2.316 0.11 0.211 4.588 2.323 0.003
安徽泾县 AHJ 1.544 1.546 2.395 0.13 0.266 2.843 2.633 0.004
安徽黄山 AHHS 1.525 1.584 2.371 0.126 0.415 3.011 2.849 0.003
安徽巢湖 AHCH 1.315 1.864 2.106 0.087 0.815 3.238 2.826 0.002
浙江千岛湖 ZJQDH 1.627 1.494 2.423 0.139 0.553 3.805 2.332 0.009
浙江衢州 ZJQZ 1.992 1.108 2.886 0.197 0.702 3.226 2.16 0.004
浙江三门 ZJSM 1.672 1.45 2.659 0.161 0.765 1.59 2.544 0.004
浙江兰溪 ZJLX 1.81 1.208 2.83 0.186 0.693 3.212 2.202 0.003
浙江文成 ZJWC 1.651 1.476 2.515 0.152 0.256 3.891 2.014 0.008
浙江台州 ZJTZ 1.702 1.353 2.763 0.175 0.567 3.032 2.482 0.009
浙江宁波 ZJNB 1.687 1.411 2.72 0.167 0.776 3.319 2.12 0.004
浙江馨昌 ZJXC 1.722 1.221 2.792 0.178 0.638 3.543 2.616 0.003
湖南衡阳 HNHY 1.448 1.724 2.206 0.104 0.932 1.712 1.582 0.010
福建南平 FJNP 1.078 2.457 1.449 0.032 0.716 3.539 2.585 0.002
福建大田 FJDT 1.094 2.252 1.744 0.062 0.428 3.229 2.792 0.008
福建政和 FJZH 1.084 2.366 1.617 0.037 0.402 2.886 2.631 0.005
福建霞浦 FJXP 1.219 2.118 1.987 0.075 0.569 2.569 2.609 0.006
四川绵阳 SCMY 1.144 2.239 1.868 0.07 0.921 2.347 1.728 0.006
四川广元 SCGY 1.255 2.03 2.033 0.08 0.661 3.031 1.66 0.006
江苏江阴 JSJY 1.349 1.78 2.12 0.091 0.445 1.856 1.692 0.002
江苏昆山 JSKS 1.361 1.743 2.142 0.095 0.731 3.831 2.366 0.006
广西柳州 GXLZ 1.228 2.056 2.016 0.078 0.532 1.757 3.001 0.004
广西玉林 GXYL 1.293 1.919 2.081 0.084 0.166 1.822 3.034 0.002

2.4 多元统计分析

2.4.1 不同产地覆盆子8种有机酸的聚类分析

为深入解析不同产地覆盆子药材的有机酸含量差异特征,对其含量结果进行了聚类分析并绘制了热图,见图2。由图2可知,根据含量差异以及省份区别,30个产地分为8类时,聚类分析能部分区分覆盆子药材的产地。浙江衢州、兰溪、台州、宁波和馨昌聚为一类,安徽歙县、浙江千岛湖、江苏昆山、浙江文成和江苏昆山归为一类,安徽亳州、绩溪、泾县、黄山、巢湖归一类,福建大田、政和和霞浦聚为一类,江西婺源、江西德兴、江西横峰和福建南平聚为一类,江西玉山和四川绵阳、四川广元聚一类,浙江三门和广西柳州、玉林聚为一类,湖南衡阳和江苏江阴聚一类。由图3亦可知,柠檬酸在不同产地覆盆子药材中的含量远高于其他酒类,富马酸含量是最低的,且含量在不同产地几乎没差异。浙江产区的覆盆子药材苹果酸含量略高于琥珀酸,广西产区的覆盆子药材琥珀酸含量最高。
图3 不同产地覆盆子药材中有机酸的聚类分析图

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2.4.2 不同产地覆盆子8种有机酸的主成分分析

对不同产地覆盆子药材的有机酸含量结果进行主成分分析,有助于将多变量归纳为少数几个综合指标,更加有助于直观分析产地导致的有机酸差异[22-23]。由表5可知,特征值大于1的前3个主成分累计贡献率达到84.399%。第一主成分的特征值为3.947,占原始数据变量信息的49.337%,其中草酸、酒石酸、苹果酸、莽草酸有较高的载荷值,表明它们对第一主成分有较高的贡献率;第二主成分的贡献率为18.749%,特征值为1.500,与第二成分相关的为琥珀酸、乙酸;第三主成分的特征值是3.305,贡献率为16.313%,与柠檬酸有较高的相关性。
表5 不同产地覆盆子药材中有机酸的主成分分析
有机酸组分 主成分1 主成分2 主成分3
草酸 0.987 0.030 0.063
酒石酸 -0.988 0.038 0.029
苹果酸 0.994 0.002 0.006
莽草酸 0.995 0.031 0.012
乙酸 0.100 0.616 -0.604
柠檬酸 0.043 0.049 0.801
琥珀酸 0.071 -0.873 -0.008
富马酸 -0.044 0.594 0.542
特征根值 3.947 1.500 3.305
累计贡献率/% 49.337 68.086 84.399

2.4.3 不同产地覆盆子8种有机酸的判别分析

以不同产地覆盆子药材中8种有机酸的含量为变量导入SIMCA 14.1(Sartorius Stedim., Sweden)软件进行OPLS-DA分析,结果见图4,根据不同产地聚为7簇,与聚类分析结果有所差异,表明8个省的覆盆子药材中的有机酸在地域上有明显差异,有助于区分产地来源。
图4 不同产地覆盆子有机酸的OPLS-DA得分图

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3 讨论

3.1 有机酸HPLC方法的建立

有机酸是覆盆子药材中重要的呈味成分之一。大量研究表明,二元酸和羟基多元羧酸如琥珀酸、柠檬酸、酒石酸等水溶性有机酸,均在210 nm波长处有较大吸收,且重复好,因此选择210 nm作为检测波长[24]。本研究选择的流动相中采用了三氟乙酸(TFA)调节pH,TFA作为最常用的离子对试剂,可通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用,能够改善峰型、克服峰展宽和拖尾等问题,同时可以避免使用磷酸缓冲盐等导致处理不当堵塞色谱柱等[25]。流动相pH过低会影响色谱柱效及使用寿命,过高会造成拖尾严重,经过不同流动相pH对有机酸混标中各物质分离的影响的对比研究显示,在pH 3.0时,各个有机酸之间分离度较好,且无拖尾现象。虽然选用的色谱柱Cosmosil 5PAQ-C18可以耐纯水,但有研究表明流动相中添加甲醇、乙腈等能改善峰形[26],本研究条件下对比显示添加2%的甲醇效果最好。流速和柱温以及进样量均经过不同对比,最终选择如1.3项的条件。

3.2 不同产地覆盆子有机酸的含量差异

本研究首次对8省30个产地的覆盆子药材中8种有机酸组分进行了分析,发现覆盆子药材中苹果酸、柠檬酸、酒石酸和琥珀酸含量较高。江西婺源、德兴、横峰均属于上饶市辖区,且地理环境较为相似,覆盆子药材中各种有机酸的含量接近,而玉山作为江西省的东大门,与婺源、德兴、横峰产地覆盆子药材中各种有机酸含量形成了差异;安徽省除了广德和歙县其他产地的覆盆子有机酸含量处于同一水平,其中琥珀酸较高,仅次于广西省;浙江省除了浙江千岛湖、三门和文成以外,其他地区聚为一类,苹果酸含量最高;福建省除了南平产地,其他3个产地8种有机酸的含量相差不大,均处于第3、4的位置。不同产地有机酸含量的差异可能跟其生境和加工方式有关。

4 结论

本研究首次建立了覆盆子药材中8种有机酸组分的HPLC定量方法,应用该方法首次分析了8省30个产地同一采收期覆盆子药材中的有机酸组分含量变化,并采用多元统计方法对结果进行了深入解析,结果发现,不同省份的覆盆子药材中有机酸含量存在差异,但可以进行区分。

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