Anesthetic Effect of Eugenol on Juvenile Schizothorax chongi

ZUOPengxiang, JINFangpeng, LENGYun, WANGZhifei, WUJunjie, YUHongman, DENGYulin, ZUXuepeng, LIMinghui, WANGJianbo, ZHANGXinghai

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Chinese Agricultural Science Bulletin ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (5) : 159-164. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0222

Anesthetic Effect of Eugenol on Juvenile Schizothorax chongi

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Abstract

To investigate the anesthetic effect of eugenol on junvenile Schizothorax chongi and provide theoretical basis for artificial breeding of Schizothorax chongi, we measured the time of anesthesia and recovery under different concentration, different anesthetic time and different exposure time by hydrostatic method. The results showed that a negative correlation between the eugenol concentration and anesthesia time was identified with y1=286.63e-0.0135x, R2=0.9593; a positive correlation between the eugenol concentration and recovery time was found with y2=101.54e0.0134x, R2=0.9913; the anesthetic time and the recovery time differed significantly with different concentration of eugenol (P<0.05); the recovery time was positively correlated with the anesthetic time (y=64.647x0.2394, R2=0.9823) under concentration of eugenol was 40 mg/L; a significant negative correlation between recovery time and exposure time was identified with y=900.92x-0.4078, R2=0.8961. The conclusion of this study was that eugenol concentration of 40-80 mg/L was the best in the production, transportation and sampling; the medicinal bath time of young fish should not exceed 600 s and the exposure time of juveniles were permitted no more than 1200 s.

Key words

eugenol / Schizothorax chongi / anesthesia effect / duration of exposure / duration of recovery

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ZUO Pengxiang , JIN Fangpeng , LENG Yun , WANG Zhifei , WU Junjie , YU Hongman , DENG Yulin , ZU Xuepeng , LI Minghui , WANG Jianbo , ZHANG Xinghai. Anesthetic Effect of Eugenol on Juvenile Schizothorax chongi. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2024, 40(5): 159-164 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0222

0 引言

细鳞裂腹鱼(Schizothorax chongi)，鲤科(Cyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、裂腹鱼属(Schizothorax)，属于中国特有的冷水性鱼类，具有较高的经济价值，野生种群主要分布于长江上游、金沙江、岷江、大渡河、青衣江及乌江下游等水域[1]。近年来由于梯级水电开发造成河流连续性的阻碍，使细鳞裂腹鱼的资源量不断减少。细鳞裂腹鱼的资源保护也开始引起国内鱼类生态学者的关注。目前在细鳞裂腹鱼人工繁殖、胚胎发育、苗种培育技术、血液学指标、繁殖生物学等方面有所研究，但对幼鱼的麻醉效果未见报道[2⇓⇓⇓-6]。水产养殖过程中，可利用物理方法（电流、低温），注射药剂等方法对鱼类进行麻醉，常用的方法是药浴为主[7]。目前已经开发的鱼用麻醉剂有利多卡因、氯美噻唑、丁香酚等近30种[8]。丁香酚(Eugenol)，无色或淡黄色液体，有强烈的丁香香气，广泛存在于丁香油、肉桂叶油、樟脑油等芳香油中。在智利和澳大利亚等国已被批准为合法使用的无残留麻醉剂[9]。中国对于水产养殖过程中的鱼用麻醉剂并未做出确切规定，但鉴于丁香酚在实践过程中表现出来的高效和高安全性的特点，并且成本也相对较低，因此丁香酚被广泛运用于亲鱼取卵、活鱼运输、鱼类科学试验中[10]。在采样、对鱼体进行标记和生物性状测量的过程中，鱼体离开水面会产生强烈的应激反应使得鱼体受伤。鱼体麻醉能有效抑制鱼类在操作中的应激反应，对鱼类起到保护作用。为了找到最适合的操作方法，同时降低鱼体应激反应带来的鱼体伤害，探索细鳞裂腹鱼幼鱼使用丁香酚最适合的浓度、麻醉液中药浴时间的长短以及幼鱼在麻醉后空气中离水操作可暴露的时间，本实验进行了丁香酚对细鳞裂腹鱼幼鱼麻醉效果的研究，以期以丁香酚作为麻醉剂，对细鳞裂腹鱼的苗种生产、增殖放流标记和分子取样等科研工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2020年6月20日在龙开口增殖站挑选龙开口鱼类增殖站繁殖的子一代幼鱼作为试验对象，试验鱼健康无疫病，试验鱼的规格：全长(10±0.25) cm，重量(8±0.5) g。挑选试验用细鳞裂腹鱼前先停食1 d，试验对象在容积为1 m3开口鱼苗培育缸中暂养7 d，暂养过程中保持进水口24 h有新水缓慢注入。试验开始前1 d停止喂食。
试验所用丁香酚，纯度为99%，购于郑州灿生物科技有限公司，将丁香酚与无水乙醇（购买于天津市风船化学试剂科技有限公司）按照1:9的体积比例混合为待用液，试验开始后按照所需试验浓度进行稀释。试验期间水温(16±3)℃，溶氧保持在6.0 mg/L以上。试验期间保持试验场所安静、减少外界干扰对鱼类造成的影响。

1.2 试验方法

1.2.1 不同浓度丁香酚对细鳞裂腹鱼幼鱼的麻醉效果试验

试验在容积为10 L的塑料箱中进行，水温为(19±1)℃，试验开始前通过气泵持续充氧。经过预实验，确定10、20、30、40、50、60、70、80、100、120 mg/L共计10个浓度梯度，并设置一个空白组作为对照。试验鱼每组10尾，设计3个平行组。试验过程中记录幼鱼的麻醉时间、复苏时间、复苏率、72 h存活率等指标。麻醉时间为幼鱼放入药液中到鱼体侧翻为准。复苏时间指被麻醉的鱼从药液中取出放回到清水中并开始以正常姿势游泳所需的时间为复苏时间[11⇓-13]。

1.2.2 不同药浴时间对细鳞裂腹鱼幼鱼复苏的影响试验

将细鳞裂腹鱼幼鱼分别置于浓度为40 mg/L的丁香酚溶液中，试验开始前通过气泵持续充氧，并分别浸泡300、420、600、900、1200、1500 s后放回清水，温度维持在20℃左右，记录复苏时间及复苏率。试验鱼每组10尾，设计3个平行组，试验过程中记录复苏时间、复苏率、复苏后72 h存活率等指标。

1.2.3 不同暴露时间对细鳞裂腹鱼幼鱼复苏的影响试验

选用40 mg/L的丁香酚浓度对长薄鳅幼鱼进行麻醉，将经过深度麻醉的细鳞裂腹鱼幼鱼暴露于空气中120、300、480、660、840、1020、1200、1380、1560、1800 s后放回清水中，记录鱼体复苏所需的时间和复苏率。试验鱼每组10尾，设计3个平行组，试验过程中记录复苏时间、复苏率、复苏后72 h存活率等指标。

2 结果与分析

2.1 不同浓度丁香酚麻醉剂对细鳞裂腹鱼幼鱼的麻醉效果

从表1可以看出，麻醉时间与麻醉浓度呈负相关，复苏时间与麻醉浓度呈正相关。当浓度为10 mg/L时，丁香酚对细鳞裂腹鱼幼鱼均不能产生麻醉效果，浓度为20、30、40 mg/L时，细鳞裂腹鱼幼鱼麻醉时间分别为(267.33±21.03) s、(178.9±13.91) s和(149.10±10.40) s，复苏时间分别为(138.07±9.72) s、(154.53±12.36) s和(175.83±13.56) s；浓度为50 mg/L和60 mg/L时，细鳞裂腹鱼幼鱼麻醉时间分别是为(136.87±6.60) s和(123.33±6.48) s、复苏时间分别为(186.73±12.09) s和(211.07±12.36) s，当浓度为80、100 mg/L时，细鳞裂腹鱼幼鱼麻醉时间均小于110 s，复苏时间范围在280~420 s，当浓度为120 mg/L时，幼鱼复苏率为95%。不同浓度下细鳞裂腹鱼幼鱼的麻醉时间呈显著性差异(P<0.05)，不同浓度下细鳞裂腹鱼幼鱼的复苏时间也呈现极显著性差异(P<0.01)。丁香酚浓度小于 100 mg/L的所有浓度梯度下试验细鳞裂腹鱼幼鱼的复苏率均为100%，复苏72 h后幼鱼存活率均为100%，详见表1。通过回归分析，麻醉浓度与麻醉时间的相关关系为式(1)。麻醉浓度与复苏所需时间的相关关系为式(2)。
y1=286.63e-0.0135x R2=0.9593
(1)
y2=101.54e0.0134x R2=0.9913
(2)
表1 不同浓度丁香酚麻醉剂对细鳞裂腹鱼幼鱼的麻醉效果
处理浓度/(mg/L) 麻醉时间/s 复苏时间/s 复苏率/
%		 复苏后72 h存活率/
%
范围 均值 范围 均值
20 234~298 267.33±21.03a 123~153 138.07±9.72A 100 100
30 157~199 178.9±13.91b 134~173 154.53±12.36B 100 100
40 131~164 149.10±10.40c 154~195 175.83±13.56C 100 100
50 127~148 136.87±6.60d 167~206 186.73±12.09D 100 100
60 112~134 123.33±6.48e 196~226 211.07±12.36E 100 100
80 86~107 96.13±6.57f 283~330 309.27±16.30F 100 100
100 69~88 78.97±6.27g 376~416 398.83±12.95G 100 100
120 49~68 57.23±4.88h 486~526 506.23±12.59H 95 80
注：同列数据肩标小写字母不同表示差异性显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。
其中x代表麻醉浓度(mg/L)，y1代表麻醉时间(min)，y2代表复苏时间(min)。详见图1。Marking等[14]认为180 s内能够麻醉、并且300 s内能够苏醒是理想麻醉剂的公认标准，按照此标准，40~80 mg/L的丁香酚麻醉液是细鳞裂腹鱼在标记、取样和生物性状测量的理想麻醉浓度。
图1 不同丁香酚麻醉剂浓度对细鳞裂腹鱼麻醉时间和复苏时间的影响

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2.2 不同药浴时间下细鳞裂腹鱼幼鱼复苏情况

在水温20℃，溶解氧6 mg/L、丁香酚溶液浓度为40 mg/L的条件下，复苏时间随着药浴时间的增加而相应延长，幼鱼复苏率随着药浴时间的增加而明显降低，不同时长下复苏所用时间呈现显著性差异(P<0.05)，详见表2。药浴时间900 s，幼鱼可以复苏，但是72 h后开始出现死亡，存活率只有80%，药浴时间1200 s时，鱼开始出现死亡，复苏率为70%，72 h后存活率60%；药浴时间1500 s时，复苏率低至50%，72 h后存活率40%。由此可见，细鳞裂腹鱼幼鱼在40 mg/L丁香酚溶液中的药浴时间不能超过600 s，详见表2，通过回归分析，在浓度为40 mg/L丁香酚溶液中，不同药浴时间与复苏所需要时间的相关关系为式(3)。呈正相关详见图2。
y=64.647x0.2394 R2=0.9823
(3)
表2 不同药浴时间细鳞裂腹鱼幼鱼的复苏情况
药浴
时间/s		 复苏时间/s 复苏率/
%		 复苏后72 h
存活率/%
范围 均值
300 202~291 248.3±26.47a 100% 100%
420 220~319 275.10±34.86b 100% 100%
600 282~326 304.87±14.16c 100% 100%
900 310~368 338.77±17.19d 100% 80%
1200 322~376 349.57±16.62e 70% 60%
1500 336~391 365.33±17.74f 50% 40%
注：同列数据肩标小写字母不同表示差异性显著(P<0.05)。
图2 不同药浴时间对细鳞裂腹鱼幼鱼复苏的影响

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2.3 不同暴露时间对细鳞裂腹鱼幼鱼复苏的影响

在水温20℃，溶解氧6 mg/L、丁香酚溶液浓度为40 mg/L的条件下，将进入麻醉状态的细鳞裂腹鱼分别暴露在空气中120~1800 s后放入水中进行复苏，幼鱼复苏时间随暴露时间的增加而缩短，不同暴露时间下的复苏时长呈现显著性差异(P<0.05)，当细鳞裂腹鱼幼鱼在空气中暴露1200 s以内，入水52 s后就可以苏醒，复苏率达100%；当暴露时间达1380 s时，幼鱼开始出现死亡，复苏率为90%，当暴露时间达1800 s时，复苏率仅有60%，72 h后存活率仅有50%，建议今后在同等条件下，麻醉细鳞裂腹鱼幼鱼在空气中暴露的时间不超过1200 s。在空气中的暴露时间对麻醉鱼体复苏影响的结果详见表3，通过回归分析，麻醉后的幼鱼在空气中的暴露时间与复苏时间的关系为呈负相关，见式(4)，详见图3。
y=900.92x-0.4078 R2=0.8961
(4)
表3 不同暴露时间对细鳞裂腹鱼幼鱼复苏的影响
暴露
时间/s		 复苏时间/s 复苏率/% 复苏后72 h
存活率/%
范围 均值
120 94~118 106.87±7.92a 100 100
300 83~102 93.50±6.18b 100 100
480 72~90 81.60±6.49c 100 100
660 63~82 72.87±6.74d 100 100
840 54~73 63.43±5.61e 100 100
1020 46~66 56.32±6.50f 100 100
1200 44~60 52.26±5.53g 100 100
1380 36~52 44.19±6.01h 90 80
1560 31~51 42.03±5.66i 75 60
1800 27~41 35.19±4.57j 60 50
注：同列数据肩标小写字母不同表示差异性显著(P<0.05)。
图3 麻醉后幼鱼在空气中暴露时长对复苏的影响

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3 讨论

3.1 不同麻醉浓度对麻醉时间和复苏时间的影响

为降低在活鱼运输、亲鱼采捕、人工繁殖、分子实验样品采集等一系列生产和实验过程中带来的鱼类应激活动，提高成活率，麻醉剂在水产养殖中的应用越来越广泛。丁香酚作为一种麻醉剂，其麻醉作用可以通过鱼鳃、消化道和皮肤黏膜传导至神经中枢系统，进而对鱼体的活力进行抑制，降低其反射力[11]。研究表明，理想麻醉浓度是能够使鱼体在180 s内入麻，300 s内复苏，且存活率达到100%的麻醉剂浓度，在理想麻醉浓度内使用麻醉剂对鱼体影响可忽略不计，超剂量使用则会对鱼体产生较大影响[12⇓-14]。本研究中，丁香酚对细鳞裂腹鱼的理想麻醉浓度为40~80 mg/L，下限较卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)幼鱼(20 mg/L)、鲻鱼(Mugil cephalus)(25 mg/L)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)(30 mg/L)幼鱼略高，与长薄鳅(Leptobotia elongata)幼鱼(40 mg/L)相同，低于大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)幼鱼(50 mg/L)、亚东鲑鱼(Salmon trutta)(50 mg/L)[15⇓⇓⇓⇓-20]，这说明了不同的鱼对麻醉剂的耐受性不同，在生产及实验过程中应根据鱼种类的不同，使用不同浓度的麻醉剂，针对细鳞裂腹进行标记、生物性状测量和取样等短时间离水操作时，建议将丁香酚麻醉浓度控制在40~80 mg/L，且每次麻醉鱼数量不超20尾，离水操作时间不超600 s，以免操作时间过长导致鱼体难以复苏；另有大量研究结果表明，随着麻醉剂浓度的增加，麻醉所需时间也相应缩短，复苏时间则逐渐增加例如：长薄鳅幼鱼、罗非鱼、鲻鱼、紫红笛鲷幼鱼、大泷六线鱼幼鱼等[16⇓⇓⇓⇓⇓-22]，而本实验的研究结果也正再次印证了这一观点：丁香酚浓度和细鳞裂腹鱼幼鱼的麻醉时间呈负相关，和复苏时间呈正相关。此外，有学者研究认为深度镇静期是最适宜的运输时期[23]，如果要长途运输，为了安全起见，经过40 mg/L的丁香酚麻醉后的细鳞裂腹鱼应立即转入含有浓度为20 mg/L丁香酚水体中进行运输，这样对细鳞裂腹鱼的影响较小。

3.2 不同药浴时间下细鳞裂腹鱼幼鱼复苏情况

本实验可以看到，在丁香酚浓度为40 mg/L时，进行300~600 s的持续药浴，细鳞裂腹鱼的复苏率和复苏后72 h存活率仍可以达到100%，但超过900 s后，虽然复苏率为100%，但是72 h后存活率为80%。这表明短时间麻醉不会导致鱼体死亡，但麻醉超过一定时间后却能致死，这与赵艳丽等[24]对大黄鱼的研究结果相似。因此，在对细鳞裂腹鱼幼鱼进行分子样品取样、标记、生物性状取样等麻醉过程中要准确掌握麻醉时间的长短，以免造成不必要的损失。

3.3 不同暴露时间对细鳞裂腹鱼幼鱼复苏的影响

研究不同暴露时间对鱼体复苏的影响，对于活体离水操作具有一定的指导意义[25]。本试验以40 mg/L浓度的丁香酚将细鳞裂腹鱼幼鱼麻醉后，再将鱼体暴露于空气之中，在暴露时间为120~1800 s内，鱼体复苏时间随着暴露时间增加而逐渐缩短，这可能因细鳞裂腹鱼幼鱼在暴露的过程中丁香酚不断的代谢或者蒸发致使进入细鳞裂腹鱼体内的丁香酚浓度降低所致。这与张志山等[26]对翘嘴鲌(Culter alburnus)的研究结果、孟庆磊等[27]对苏氏圆腹（鱼芒）(Pangasius sutchi)的麻醉研究结果以及陈德芳等[28]对鲫鱼(Carassius aura- tus)的研究结果相似，与严银龙等[29]对刀鲚(Coilia nasus)的研究结果相反，这可能是鱼的种类不同所致。另外，麻醉后的细鳞裂腹鱼在空气中暴露1200 s内复苏后72 h存活率均为100%，当暴露时间增加至1380 s时，复苏率降低到了90%，复苏后72 h内存活率为80%。这表明，在对细鳞裂腹鱼幼鱼进行离水操作时，需将操作时间控制在1200 s以内，以确保细鳞裂腹鱼幼鱼的安全。

4 结论

综合以上结果，可以得出：细鳞裂腹鱼鱼在20℃水温下进行麻醉试验时，选用的丁香酚浓度控制在 100 mg/L以下，但理想麻醉剂浓度为40~80 mg/L；当丁香酚浓度为40 mg/L，药浴时间不应超过600 s；当水温20℃，溶解氧6 mg/L，丁香酚浓度为40 mg/L情况下，麻醉细鳞裂腹鱼幼鱼在空气中暴露的时间不超过1200 s。

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【研究目的】为了了解麻醉剂丁香酚对鱼类养殖的影响，适量麻醉是否可以降低操作带来的应激反应。【方法】通过对罗非鱼进行适量麻醉和无麻醉直接处理后，检测不同时间捕捉处理后罗非鱼血浆中皮质醇和乳酸动态变化，研究鱼用麻醉剂丁香酚对罗非鱼捕捉应激的影响。【结果】结果显示：在10~120 mg/L范围内，随着丁香酚药浴浓度的增加，罗非鱼麻醉时间逐渐缩短，苏醒时间逐渐增长，实验选取的最适麻醉浓度为45 mg/L。捕捉后0、30、60 min三个取样点，丁香酚处理组罗非鱼血浆中皮质醇浓度降低，但各时间点无显著性差异(P&gt;0.05)，直接捕捉处理组皮质醇浓度显著增加(P&lt;0.05)。0 min时处理组皮质醇浓度显著低于对照组，30、60 min时处理组极显著低于对照组(P&lt;0.01)。捕捉后两个处理组0 min血浆中乳酸浓度无显著差异；直接捕捉处理组30 min和60 min血浆中乳酸浓度显著高于0 min(P&lt;0.05)，且显著高于丁香酚处理组0 min、30、60 min三个取样点 (P&lt;0.05)，丁香酚处理组血浆中乳酸浓度差异不大。【结论】结果表明：在理想麻醉剂量下，将罗非鱼使用丁香酚进行麻醉后捕捞、运输等操作，可避免捕捉后鱼体皮质醇和乳酸浓度的激增，有效降低罗非鱼的捕捉应激。
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