Research on the Photosynthesis Ability of Pairs polyphylla var. yunnanensis from Different Areas

Wang Yihao, Li Shichang, Liu Chunlu, Zhao Yanli, Zheng Guowei, Xu Furong

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Chinese Agricultural Science Bulletin ›› 2021, Vol. 37 ›› Issue (16) : 59-64. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0828

Research on the Photosynthesis Ability of Pairs polyphylla var. yunnanensis from Different Areas

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Abstract

To study the adaptability of Pairs polyphylla var. yunnanensis and provide a theoretical basis for its introduction, planting and resource protection, we investigated the photosynthetic capacity of P. polyphylla var. yunnanensis from different growth areas and different sources from the same area. LI-6800 photosynthesis instrument was used to detect the photosynthetic capacity of the same variety from different areas and different sources from the same area. The results show that the photosynthetic capacity of P. polyphylla var. yunnanensis collected from western Yunnan is higher than that from southeastern Yunnan, and the difference is great. There is no significant difference in photosynthetic rate of P. polyphylla var. yunnanensis among different sources in southeastern Yunnan, but the value is lower than that in western Yunnan. However, the leaf stomatal conductance (Gs), transpiration rate (Tr) and water use efficiency (WUE) of P. polyphylla var. yunnanensis from different habitats are lower than those of local varieties, while the ratio of intercellular CO2 concentration to environmental CO2 concentration (Ci/Ca) was higher than that of local varieties, and the photosynthetic capacity of transplanted varieties is lower than that of local varieties. The study shows that the photosynthetic capacity of P. polyphylla var. yunnanensis in western Yunnan is stronger than that in southeastern Yunnan, especially in Yongping County of Dali prefecture. However, the photosynthetic capacity and water use efficiency of the transplanted varieties are lower than those of the local varieties. So in the cultivation of Pairs polyphylla var. yunnanensis, the cultivated local varieties should be selected for artificial expansion.

Key words

Pairs polyphylla var. yunnanensis / geographical origin / resource protection / provenance / photosynthesis / light response curve

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Wang Yihao , Li Shichang , Liu Chunlu , Zhao Yanli , Zheng Guowei , Xu Furong. Research on the Photosynthesis Ability of Pairs polyphylla var. yunnanensis from Different Areas. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2021, 37(16): 59-64 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0828

0 引言

三七[Panax notoginseng (Burkill) F. H. Chen (Araliaceae)]为五加科人参属多年生草本植物,具有活血化瘀、消肿止痛的功效,广泛应用于高血压、血栓及动脉粥样硬化等疾病的治疗[1]。然而,三七的种植周期长达3~5年,在此过程中常遭遇病害困扰,其中根腐病是影响其品质的重要病害之一。根腐病表现出多种症状,包括茎基干枯型、黄腐型和急性青枯型等,并可在不同生长年限内发生。研究表明,尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌以及毁坏柱孢霉是导致三七根腐病的主要致病真菌。此外,灰葡萄孢和胶孢炭疽菌也会引发三七地上部分的疾病,这些问题严重影响了三七的质量,给农民带来了严重的经济损失[2-3]。因此,开发低毒性、易降解且无污染的植物源天然新型杀菌剂已成为当前研究的热点之一。
植物来源的天然杀菌剂,如植物精油,因其多样的生物学特性及绿色环保优势,在农业生产中的应用日益广泛[4]。彭媛媛等[5]发现浓度为6.4 μL/mL的山苍子精油能够有效抑制枝孢菌菌丝生长,并改变其分子结构和功能基团。吴金勇[6]的研究显示,牛至与鱼腥草精油联合使用主要通过破坏微生物细胞膜和细胞壁来影响基因表达、细胞呼吸及能量代谢等途径,抑制病原菌生长甚至导致其死亡。此外,由于精油成分复杂,作用靶标位点众多,可通过调节蛋白质合成和基因转录水平来影响细胞生命活动。赵星辰等[7]从蛋白质水平验证了亚抑菌浓度茶树油对金黄色葡萄球菌α-溶血素的产生具有显著抑制效果,这表明精油在不同程度上可影响细胞生命活动,展现出良好的开发潜力。
本课题组前期研究表明中药材高良姜、薄荷、八角精油均能显著抑制尖孢镰刀菌、层出镰刀菌的菌丝生长。为扩大精油抑菌研究,对富含精油药材进行筛选,发现常见的抗真菌植物主要分布在唇形科、姜科、菊科和天南星科。石菖蒲和艾叶分别属于天南星科和菊科蒿属植物,气味芳香,且富含精油。刘铁秋等[8]在研究中发现,石菖蒲醇提物能够有效抑制番茄灰霉菌丝的生长和孢子萌发。李少华等[9]研究表明,石菖蒲醇提物对苹果炭疽病菌具有显著的抑制作用。赵玉婷等[10]认为,蕲艾挥发油对金黄色葡萄球菌、黄曲霉菌和枯草芽孢杆菌均表现出良好的抑制效果。由此可见,采用石菖蒲和艾叶提取精油具备一定的理论依据。然而,目前关于石菖蒲和艾叶的研究主要集中于抗炎、杀虫及镇痛等领域[11],针对三七致病菌的相关研究仍较为稀缺。
不同精油所含化学成分呈现多样性,这些成分之间往往存在复杂的相互作用。因此,将多种精油进行复配不仅可以扩展其抗菌谱,还能有效增强其抑菌效果。因此,本文旨在研究石菖蒲和艾叶精油及其主要化合物——β-细辛醚、α-细辛醚、石竹素、β-石竹烯、桉油精以及桃金娘烯醛的抗真菌作用。同时,探讨这些成分与化学农药恶霉灵联用对四种病原真菌的影响,以期为植物源农药的创新开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试药材、供试植物病原菌、供试单体

供试药材:石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott)和艾叶(Artemisia argyi Levl.et Vant.)于2021年9月26日购于云南金发药业有限公司(中国云南昆明,图1)。以上材料经云南中医药大学邱斌教授鉴定为天南星科植物石菖蒲属(Acorus)和菊科蒿属(Artemisia)植物的根茎,保存于云南中医药大学,批号分别为SCP1和AY1。
图1 石菖蒲和艾叶中药材

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供试病原菌:根据研究报道,采用组织分离法对发病三七进行病原菌分离[12],其中,3株形态不同真菌菌株从根腐病三七(表现为叶片萎靡黄化,下垂脱落,根部腐烂)中分离得到,1株从炭疽病(表现为茎秆扭曲,叶片萎蔫,根块腐烂)三七中分离获取。将培养7 d、菌丝毛绒且长势良好的4株真菌菌株,使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌DNA,利用真菌内转录间隔ITSI区和ITSⅡ区引物(ITS15'-TCCGTAGAGAACCTGG-3'和ITS4,5'-TCCTCGCT TATGC-3')进行扩增,将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,所得核苷酸序列上传至NCBI-Blasts(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对,结合形态学特征和科赫氏法则,分别鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),其菌丝毛绒絮状,呈淡紫色;腐皮镰刀菌(Fusarium solani),其菌丝体白色,高而紧密;毁坏柱孢霉(Cylindrocarpon destructans),菌丝体呈蓬松紧密絮状,颜色为深褐色;胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides),菌体中间菌丝呈毛绒黑色,边缘呈白色。三七致病菌与研究报道一致[3]。其中,胶孢炭疽菌置于22℃生物培养箱培养,其他3株真菌在28℃生物培养箱培养(型号:DHP-9051,上海一恒科学仪器有限公司)。
供试单体:β-细辛醚(纯度≥98.5%,批号A001)购自成都普实生物科技有限公司(中国成都)。桉油精(纯度≥99%,批号B001)和α-细辛醚(纯度≥99%,批号B002)购自上海麦克林生化有限公司(中国上海)。石竹素(纯度≥99%,批号C001)和β-石竹烯(纯度≥98%,批号C002)从上海陶术生物科技有限公司购买。恶霉灵(纯度≥97%,批号D001)购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 精油提取及检测

1.2.1 水蒸气蒸馏法提取精油

采用水蒸气蒸馏法提取精油。精油提取后,用无水硫酸钠干燥,密封于棕色瓶中,于-20℃保存,用于进一步分析。

1.2.2 色谱/质谱分析精油化学组分

试验所用的气质联用仪型号为7890B-5977B(Agilent Technologies Inc.);色谱柱型号为毛细管柱HP-5MS (30 m×0.25 μm×0.25 μm)。参数设置为:载气为氦气,流速为1.2 mL/min,柱温初始温度设置为50℃保持4 min,后以5℃/min的速率升至120℃,最后以10℃/min的速率上升至280℃并保持16 min。
质谱(MS)的条件为:传输线温度和离子源温度分别为150℃和230℃,扫描范围和电离电位分别为30 ~ 500 m/z和70 eV。每个样品重复3次,根据正构烷烃的保留时间计算相应的RI值,最后通过NIST17谱库比对,确定化合物。

1.3 精油及其单体化合物抗菌活性测定

1.3.1 石菖蒲精油和艾叶精油抗菌活性测定

根据改良版牛津杯实验[13]进行石菖蒲精油和艾叶精油的抗菌活性测定,具体步骤为:精密量取适量精油,溶解于1% DMSO~0.1% T-80混合溶剂中,精油的初始浓度为50 mg/mL,不含精油的溶剂作为阴性对照。恶霉灵为高效、广谱的化学杀菌剂,对农作物多种病原菌引起的病害均有较好防治效果,故本实验选取并配置浓度为5 mg/mL的恶霉灵作为阳性对照,每个处理3次重复,置于真菌培养箱中培养,十字交叉法测量菌落直径大小。
 菌丝生长抑制率 = 阴性对照组直径  处理组直径  阴性对照组直径 ×100%
(1)

1.3.2 石菖蒲精油和艾叶精油及其主要成分MIC的测定

采用根据二维棋盘微量稀释改良成的96孔板法[14]测定精油及其主要成分对4种真菌的MIC。精密量取精油溶于1% DMSO-0.1% T-80混合溶液中,充分混匀后经0.22 μm Millipore滤膜过滤备用。采用二倍稀释法配制浓度为75~0.1465 mg/mL的精油溶液。加入50 μL精油溶液和150 μL孢子悬浮液于96孔板中,每个浓度8个重复。阴性对照组为50 μL 1% DMSO~0.1% T-80混合溶液和150 μL孢子悬浮液。同样,恶霉灵和精油单体组分操作方法同上,初始浓度为10 mg/mL。置于生物培养箱培养12 h以上,经酶标仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)在595 nm波长处测量每个孔的吸光值,并计算该精油MIC值。

1.3.3 两种精油混合联用及与化学杀菌剂恶霉灵联用FICI的测定

艾叶精油和恶霉灵,石菖蒲精油和艾叶精油联合应用的抗菌活性,浓度设置为8MIC-1/16MIC,此时每孔加入25 μL的混合精油溶液,其余方法同1.3.2。
通过FICI评定联合抑菌效果:
FICI=MICMIC+MICMIC
(2)
FICI指数的判断标准:当精油的综合效应大于单种精油作用之和时,视为协同作用;当精油的综合作用等于单种精油作用之和时,视为加和作用;当两种精油的总和效应无相关时视为无关作用;当多种精油同时使用,其效果比单独使用时的效果小,视为拮抗作用。
FICI≤0.5,协同作用;0.5<FICI≤1.0,加和作用;1.0<FICI≤4.0,无关作用;4.0<FICI,拮抗作用。

1.4 数据分析

数据处理和分析软件为SPSS Statistic 19.00,数据均为‘均值±标准误’,制图软件为GraphPad Prism 8.0.1。

2 结果与分析

2.1 石菖蒲精油和艾叶精油抗真菌活性结果

石菖蒲精油和艾叶精油对4种真菌的菌丝生长有不同程度的抑制作用(图2图3)。浓度为50 mg/mL的石菖蒲精油对胶孢炭疽菌抑制作用最强,抑菌率为77.27%;其次是毁坏柱孢霉,抑菌率为58.23%;对尖孢镰刀菌抑菌率为44.95%,对腐皮镰刀菌抑制作用最弱,抑菌率为32.74%。浓度为50 mg/mL的艾叶精油对胶孢炭疽菌抑制作用最强,抑制率为100%;其次是尖孢镰刀菌,抑制率为66.23%;对腐皮镰刀菌抑制率为46.90%,对毁坏柱孢霉的抑制作用最弱,抑制率为32.19%。浓度为5 mg/mL的恶霉灵对胶孢炭疽菌抑制作用最强,抑制率为100%;其次是尖孢镰刀菌,抑制率为81.38%;对毁坏柱孢霉抑制率为55.29%,对腐皮镰刀菌的抑制率最弱,抑制率为13.27%。
图2 石菖蒲精油和艾叶精油对4种真菌的抑制作用

1:尖孢镰刀菌;2:腐皮镰刀菌;3:毁坏柱孢霉;4:胶孢炭疽菌。A:阴性对照;B:石菖蒲精油处理组;C:艾叶精油处理组;D:阳性对照组。精油浓度为50 mg/mL,恶霉灵浓度为5 mg/mL

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图3 石菖蒲精油和艾叶精油对4种真菌的抑制率

同一处理组不同小写字母表示在P<0.05水平上具有显著性差异。精油浓度为50 mg/mL,恶霉灵浓度为5 mg/mL

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2.2 精油化学组分检测结果

从石菖蒲精油中共鉴定出34个化合物,主要分为醛类、酮类、酚类、酸类、醛类等,其中,醇类和酮类占比最大(图4A),且主要成分中β-细辛醚(31.06%)和α-细辛醚(15.14%)属于醚类,为主要化合物,其次表水菖蒲酮属于酮类占比10.94%、异水菖蒲二醇和顺式-甲基异丁香油酚属于醇类和酚类,分别占比6.11%和5.45%(图4C)。从艾叶精油中共鉴定出98个化合物,主要分为醇类、酮类醚类、酚类等,其中醚类和酮类占比较大(图4B),石竹素和β-石竹烯为主要化合物,分别占比7.8%和7.57%,其次是桉油精和右旋樟脑属于醚类和酮类,分别占比4.74%和4.17%,桃金娘烯醛属于醛类,含量为3.44%,拉凡醇、2-茨醇、(-)-4-萜品醇 均属于醇类,但含量占比较小(图4D)。
图4 石菖蒲精油和艾叶精油GC-MS化学成分分析

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2.3 石菖蒲精油和艾叶精油对病原真菌的最小抑菌浓度(MIC)测定结果

通过GC-MS检测精油的化学成分后,为确定精油中化合物的抑菌活性,选取石菖蒲和艾叶精油中含量较高,市面上易获得的单体进行后续实验。对石菖蒲精油主成分β-细辛醚、α-细辛醚和艾叶精油主成分石竹素、β-石竹烯和桉油精等5种主要成分测定其最小抑菌浓度(MIC)。精油及主要成分对4种真菌的MIC图5所示。石菖蒲精油对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、毁坏柱孢霉和胶孢炭疽菌的MIC为0.44~0.27 mg/mL,其中,对尖孢镰刀菌的MIC值为0.27 mg/mL,抑制作用较强。β-细辛醚和α-细辛醚的MIC分别为0.17~0.09 mg/mL和0.31~0.07 mg/mL,其中,对尖孢镰刀菌的MIC值为0.31 mg/mL,腐皮镰刀菌的MIC值为0.07 mg/mL。艾叶精油对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、毁坏柱孢霉和胶孢炭疽菌的MIC为0.73~0.48 mg/mL,其中,对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的MIC值分别为0.73 mg/mL和0.48 mg/mL;石竹素和β-石竹烯对4种病原真菌的MIC分别为1.09~0.23 mg/mL和1.07~0.11 mg/mL,均对毁坏柱孢霉的作用较小。桉油精和桃金娘烯醛对4种真菌的MIC分别为1.56~1.25 mg/mL和0.47~0.16 mg/mL,桃金娘烯醛的抑菌活性优于桉油精。石菖蒲精油的主成分β-细辛醚和α-细辛醚的抑菌活性与化药恶霉灵相当。
图5 精油及其组分的MIC测定

同一处理组不同小写字母表示在P<0.05水平上具有显著性差异。

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2.4 精油与化学杀菌剂恶霉灵联合应用的结果

单一精油用量过大刺激性较强,并且成分间存在差异,复配使用可展现出不同的抗菌活性,且复配精油体系的确定多以单一精油混溶调配,并根据气味和功效确定最终复配体系。精油复配可通过计算分级抑菌浓度(FICI)指数判断药物间的协同、相加、无关及拮抗作用,是最常用的联合药敏方法之一。精油与化学杀菌剂恶霉灵相互作用见表1。根据FICI指数的判断标准,石菖蒲精油和艾叶精油、石菖蒲精油和化学杀菌剂恶霉灵两两组合对尖孢镰刀菌菌的FICI值均为0.5625,呈现出加和作用;石菖蒲精油和艾叶精油联合应用对毁坏柱孢霉的FICI值均为1.0625,表现出无关作用;石菖蒲精油和化学杀菌剂恶霉灵对毁坏柱孢霉和胶孢炭疽菌的FICI值分别为1.0625和1.125,为无关作用;艾叶精油和化学杀菌剂恶霉灵对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的FICI值分别0.5625和0.75,为加和作用;对毁坏柱孢霉和胶孢炭疽菌的FICI值分别为1.125和1.0625,呈现出无关作用。推测精油和恶霉灵的两两混合使用对三七致病菌有着不同程度的抑制作用。
表1 石菖蒲精油、艾叶精油及恶霉灵两两组合FICI结果
病原菌 石菖蒲+艾叶 石菖蒲+恶霉灵 艾叶+恶霉灵
尖孢镰刀菌 0.5625(加和) 0.5625(加和) 0.5625(加和)
腐皮镰刀菌 1.0625(无关) 1.000(加和) 0.7500(加和)
毁坏柱孢霉 1.0625(无关) 1.0625(无关) 1.1250(无关)
胶孢炭疽菌 1.0625(无关) 1.1250(无关) 1.0625(无关)
注:FICI≤0.5,协同;0.5<FICI≤1.0,加和;1.0<FICI≤4.0,无关;4.0<FICI,拮抗。

3 讨论与结论

化学杀菌剂是当前农业中应用最广泛的杀菌剂,其快速有效的抗真菌特性符合现代农业的需求。然而,这类杀菌剂也存在一些问题,如残留量较大、易造成环境污染、病原微生物容易产生抗药性,从而对环境和人类健康构成威胁。因此,寻找环保、无污染且低毒性的天然杀菌剂显得尤为重要,已成为近年来研究领域中的热门课题之一。
精油是石菖蒲和艾叶的次生代谢产物,具有广谱抗菌活性。DENG等[15]的研究发现,石菖蒲的甲醇提取物对多种植物病原真菌,如菠萝黑腐病菌、芒果叶枯病菌及尖孢镰刀菌等,展现出较强的抗菌效果。ARASU等[16]评估了刺毛黧豆、菖蒲、芝麻和大蒜四种精油对黄曲霉、黑曲霉、点青霉以及小孢根霉的抗菌活性,并发现其均表现出显著抑制作用。张萍等[17]提出,艾叶精油对大肠杆菌和白葡萄球菌均具备良好的抑制效果。沐杨的研究表明,艾叶提取物能够显著抑制百香果茎基腐病原真菌尖孢镰刀菌[18]。本研究通过牛津杯法测试了50 mg/mL浓度下石菖蒲精油与艾叶精油对4种真菌的抑制活性。结果显示,不同类型的精油对于各类病原真菌具有不同程度的抑制作用。其中,石菖蒲精油和艾叶精油对胶孢炭疽菌表现出显著抑制效果,而对于其他3种真菌(尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌及毁坏柱孢霉)的抑制活性则相对较低。这一结果与前人研究结论一致。推测该现象可能源于不同病原真菌对于各类精油中主要成分存在差异化敏感性,同时也说明在一定浓度下,石菖蒲与艾叶两种精油能够影响三七相关病原真菌菌丝体正常生长。
精油的主要成分是其抑菌活性的关键来源。王月亮等[19]通过无溶剂微波法和水蒸汽蒸馏法提取石菖蒲精油,检测出41种挥发性物质,其中主要成分为α-细辛醚和β-细辛醚。张萍等[17]采用水蒸气蒸馏法提取艾叶中的挥发性成分,结果显示主要成分包括β-石竹烯、桉油精、右旋樟脑及桃金娘烯醛等,这与GC-MS鉴定所得的结果一致。这为后续选取主成分进行进一步研究提供了重要依据。
不同精油及其化合物对病原菌的响应存在显著差异。本实验通过测定精油及其主要成分的最小抑菌浓度(MIC),并选取在农业生产中应用广泛的化学杀菌剂恶霉灵作为参照。结果表明,石菖蒲精油和艾叶精油对毁坏柱孢霉和胶孢炭疽菌的MIC值较低,而对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌的MIC值则相对较高。此外,石菖蒲精油中的主要成分β-细辛醚和α-细辛醚,其MIC值与化学杀菌剂恶霉灵相当。笔者推测,这可能与不同病原菌对精油中各类化合物空间构效关系具有选择性,从而表现出不同程度的抗真菌活性。同时,也推测精油中不同化合物作用于真菌时具备多样性的靶点。这为后续深入研究精油主效单体成分的抑制机制奠定了基础。
为了更有效地控制植物病害,多药联合的应用在农业中愈发广泛[20]。因此,本实验通过研究精油与恶霉灵的两两联合应用,发现二者联用时出现了协同作用。这可能是由于精油中多种化学成分与恶霉灵混合后形成生物多样性共同作用的结果。精油的混合使用能够在一定程度上有效降低化学杀菌剂的毒性,减缓土壤中微生物产生耐药性的速度,并扩大抗菌谱,从而提高多药耐药菌对杀菌剂的敏感性[21]。同时,这为解决植物精油在抗菌应用时所需用量较大、气味单一且浓烈刺激等缺点提供了理论依据。然而,目前关于石菖蒲和艾叶精油多种用药联合的研究仍然较少,同时对于这两种精油对病原菌作用机制尚不明确。因此,未来可结合转录组、代谢组等多组学方法深入阐明石菖蒲和艾叶精油的抑菌机理。本研究发现石菖蒲和艾叶精油与恶霉灵联用后,对尖孢镰刀菌呈现出加和效应,这为后续开发植物源杀菌剂具有重要意义。
本研究测定了同一浓度的石菖蒲和艾叶精油对4种三七病原菌的菌丝生长抑制效果,结果显示二者均表现出不同程度的抑制作用。其中,浓度为50 mg/mL的石菖蒲和艾叶精油对胶孢炭疽菌的抑制效果最为显著,抑制率分别达到77.27%和100%。通过GC-MS分析,笔者鉴定出石菖蒲精油中含有34种化合物,而艾叶精油则包含98种化合物。进一步筛选其主要成分并测定最低抑菌浓度(MIC),结果表明两者均展现出良好的抗菌活性。最后,将石菖蒲与艾叶精油与恶霉灵进行混合联用后,对尖孢镰刀菌表现出了协同作用。综上所述,这些结果表明石菖蒲精油和艾叶精油在防治三七病害方面具有作为绿色杀菌剂的潜力,为绿色农药开发提供了可行的理论依据。

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