Isolation, Identification and Virulence Gene Analysis of an Aeromonas hydrophila from Diseased Pelodiscus sinensis

Xue Mingyang, Zhou Yong, Liang Hongwei, Li Xiang, Fan Yuding, Zeng Lingbing, Qu Chunjuan, Meng Yan

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Chinese Agricultural Science Bulletin ›› 2021, Vol. 37 ›› Issue (20) : 152-159. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0484

Isolation, Identification and Virulence Gene Analysis of an Aeromonas hydrophila from Diseased Pelodiscus sinensis

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Abstract

The study aims to determine the pathogen causing disease in a Chinese soft-shelled turtle farm in Anhui Province, and provide reference for effective prevention and control of the disease in future production. The pathogenic bacteria were isolated from the moribund turtle with typical symptoms under aseptic condition, and then were identified by the morphological examination, biochemical analysis, and sequence analysis of bacterial 16S rDNA. The drug susceptibility test was conducted by Kirby-Bauer agar diffusion method, and the virulence genes of the pathogen were analyzed. The results showed that the pathogen was identified as Aeromonas hydrophila, called AM-1. Artificial infection showed that the typical symptoms of the disease could be replicated as the ones naturally occurred and this bacterium was of high pathogenicity to Chinese soft-shelled turtle. The drug resistance tests showed that the isolated pathogen was highly sensitive to enrofloxacin and levofloxacin, while extremely resistant to cotrimoxazole, ampicillin and tetracycline. The amplification results of 6 virulence genes showed that the isolated pathogen carried 5 virulence genes including aerolysin, heat-labile enterotoxin, heat-stable enterotoxin, hemolysin and elastase. This study indicates that Aeromonas hydrophila AM-1 is the pathogenic bacteria which could cause the deadly disease outbreak of the Chinese turtle. Enrofloxacin and levofloxacin can be used for treatment.

Key words

Pelodiscus sinensis / Aeromonas hydrophila / virulence gene / pathogenicity

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Xue Mingyang , Zhou Yong , Liang Hongwei , Li Xiang , Fan Yuding , Zeng Lingbing , Qu Chunjuan , Meng Yan. Isolation, Identification and Virulence Gene Analysis of an Aeromonas hydrophila from Diseased Pelodiscus sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2021, 37(20): 152-159 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0484

0 引言

改革开放以来,化肥的使用在提高中国作物的单位面积产量方面发挥着重要作用,重施化肥成为实现增产的关键措施之一,这导致农业生产中化肥投入量越来越大[1,2]。长期过量、不合理的化肥使用,使养分失衡、连作障碍、盐渍化、板结等土壤问题突显,对作物生长发育、果实产量和品质形成及土壤生态环境等造成不良影响,不利于现代农业的可持续发展[3]。推进有机肥代替部分化肥,优化施肥方案,降低化学肥料的投入量迫在眉睫。
长期施用有机肥有利于土壤结构的改善和氮素的积累[4]。有机、无机肥的合理配施对作物生物量提高及养分积累具有积极作用[5]。目前,对于人畜粪便、秸秆等有机废弃物鼓励将其发酵腐熟后作为固体有机肥就地应用,但固体有机肥多用作基肥使用,不利于无土栽培及水肥一体化灌溉。有机液肥是一种由人畜粪便、农业废弃物、渔业下脚料等有机物料或可做有机肥源的矿物粉等为原料,在微生物作用下发酵制备成的液体有机肥料,它富含无机营养物质、有机营养物质、有益微生物及其代谢产物等。有机液肥结合了水、肥两种模式,在农业生产中使用,可为作物提供所需养分,且具有较好的生物防治功能和改良土壤生态环境的作用,养分利用率高,有利于优质农产品生产[6,7]。中国农业生产有使用有机液肥的传统,如腐熟人粪尿、沼液等在传统农业中广泛应用,是作物栽培的主要养分来源。近年来,随着人们对安全、优质农产品的追求,及化肥、农药减量政策的引导,有机液肥的开发与应用成为关注热点。目前,蚯蚓液肥、鱼蛋白液、氨基酸液肥等新型或功能型有机液肥的应用研究成果较为丰富,关于以农牧业废弃物为原料的有机液肥发酵理论研究和装备开发报道已有不少,各种类型的有机液肥均已在农业生产中应用[8,9,10]。然而,有机液肥具有活性物质不稳定,速效养分含量偏低等缺点,其运输、储存及使用上均存在局限,在现代农业中被普遍使用还面临困难和挑战。因此,本文将从有机液肥的特性、功能、种类、制备工艺研究、使用方法和应用效果等几方面进行综述,针对在农业生产应用中存在的问题浅谈建议,旨在为《果菜茶有机肥代替化肥行动方案》实施创新技术途径,为推进有机液肥在现代农业生产中应用拓宽思路。

1 有机液肥在农业生产中的作用和意义

有机液肥用于农业生产可以为作物生长提供有效的营养物质,也可以调整土壤微生物结构、丰富群落结构,改善土壤理化性质,还可以有效缓解土壤重金属污染对作物生长的影响[11,12,13]

1.1 有机液肥为植物生长提供营养物质

有机液肥中含有作物生长所必须的矿质元素及小分子物质,可为作物供给养分,保持植株体内活性,增加植株蛋白质含量,有利于养分吸收和营养转化,对促进作物生长发育和改善品质、提高产量具有积极的影响[14]。张林山等[15]研究结果表明,在‘锦绣’黄桃上施用蚯蚓有机液肥,长期施用可促进树体营养吸收,果实中可溶性固形物含量增加。贾云等[16]通过研究有机液肥对设施葡萄生长的影响,发现追施蚯蚓液体肥可显著提高葡萄茎叶的全N、全P、全K含量,葡萄风味也有所增强。有机液肥集速效性养分和缓效性养分于一体,可为植物生长提供营养,有利于根系对营养物质的吸收、储存和转化,促进根系生长发育,对培育壮苗具有重要意义[17,18]。有机液肥也可作为叶面肥使用,周艳孔等[19]通过试验证明叶面喷施复合微生物菌肥、坤之缘蚯蚓有机液肥均可提高草莓可溶性糖含量、糖酸比、VC等品质指标。

1.2 有机液肥具有生物防治功能

有机液肥中含有大量的微生物,对病原菌具有直接的抑制作用,还可诱导植株抗性[20]。蔬菜追肥施用有机液肥,根施与叶面喷施相结合对蔬菜中白粉虱、蚜虫等病虫害具有一定的抗性[21];牛粪堆肥茶原液对裸仁美洲南瓜白粉病具有良好的防治效果[22]。赵丽娅等[23]通过试验证明,有机液肥对病原菌的防病效果受肥料用量、施肥方式、及灭菌状况等因素的影响,施用有机肥可丰富土壤微生物,丰富的营养物质可刺激植物增强其抗性。

1.3 有机液肥对土壤的改良作用

有机液肥对土壤的物理性质、化学性质及生物学性状具有一定的影响。施用有机液肥可增强土壤保水保肥的功能,提高土壤含水率,土壤有机质含量随有机液肥用量的增大而增加,有效改善土壤表层结构,提高养分供给力,为作物生长提供适宜的生存环境[24];还有效缓解酚酸胁迫对土壤酶活性的影响[25]。周德平等[26]同样认为:施用生物有机液肥可增加土壤微生物数量,增强微生物的代谢能力和代谢功能多样性,速效P、K含量显著增多,有效改良土壤环境。谢亚军等[27]利用辅酶Q10发酵液制成的有机液肥,施入土壤后可增强土壤酶活性,对提高植物叶绿素含量和生物量具有促进作用。

2 有机液肥的种类及其制备

2.1 有机液肥的种类

在中国,传统的有机液肥主要为腐熟的人粪尿、沼液等,随着人们对高效化、优质化有机液肥的需求,新型有机液体肥和功能性液体肥被研发制备。主要有沼液配方有机液肥、堆肥茶、海藻生物有机液肥、鱼蛋白有机液肥、蚯蚓有机液肥、以腐殖酸、氨基酸为原料的液体肥料、以壳聚糖、蜜糖等为原料的有机水溶肥等。沼液,是有机物料经厌氧发酵后的液态产物,营养丰富且易被吸收利用,长期的厌氧发酵环境可抑制大部分病菌、虫卵生长甚至导致窒息死亡,有害微生物减少,营养丰富且养分利用率高,具有良好的利用效果和较高的应用价值[27,28,29];堆肥茶,是将堆置腐熟的有机物料经发酵浸提后所获得的一种液体肥料,是固体有机肥料的二次发酵产品;在通氧条件下炮制,有益微生物被活化,可为作物生长营造一个良好的环境[30,31];海藻生物有机液肥,是以褐藻类为原料,将其研磨成浆,经酶解后添加微生物菌剂进行发酵而成,可促进作物生长、提高产量和品质[32];鱼蛋白有机液肥,是低值鱼类通过酶解后所得到的有机降解液,施入土壤有利于土壤酶活性增强,促进有机质的分解转化,具有改良土壤环境的功效[33];蚯蚓有机液肥是以蚯蚓为原料制备成的一种有机活性液体肥料[34,35]。以腐殖酸、氨基酸为原料的液体肥料获得农业农村部行政许可的产品达4000多个。以壳聚糖、蜜糖等为原料的有机水溶肥料在农业生产中的应用效果也较好。壳聚糖是一种天然阳离子多糖,是甲壳素经乙酰化得到的,甲壳素广泛存在肢体动物的外壳、软体动物的内壳、菌类、藻类的细胞中及高等植物的细胞壁中,该物质具有可溶性、保湿性、诱导抗病性等特点,可改善土壤性状、促进根系生长、提高蔬菜产量和改善品质[36]

2.2 有机液肥的制备

有机液肥的肥效及生物防治受多种因素的影响,如原料组成与配比,温度,发酵过程是否通氧(溶氧量)等[37]
有机液肥是以富含N、P、K等营养物质的作物秸秆、禽畜粪便、动物残体及可做有机肥源的矿物质粉等为原料,原料组成与配比影响着有机液肥的营养成分和功效。李惠[38]将猪粪、牛粪、羊粪分别与小麦秸秆进行混合,通过好氧发酵的方法制成有机液肥,通过对比发现猪粪浸提液中有机质、矿质营养含量最高;徐静[39]等以菇渣、药渣、混合渣(由菇渣与药渣混合而制成)、牛粪堆肥,4种有机肥为原料制成有机液肥,菇渣堆肥茶真菌数量增加最多,更有利于番茄植株株高、茎粗和生物量的积累,牛粪堆肥茶有机质含量、全氮、全磷含量,以及电导率最高。同一种堆肥有机物料,采用不同提取剂、浸提时间、浸提温度、通气量,都会影响有机液肥最终的养分含量[40]
好氧发酵和厌氧发酵是有机液肥发酵的2种形式。好氧发酵方式下,有机质易被氧化分解,同时释放较多热量,有效杀灭有害菌和病虫卵;溶解氧浓度对好氧微生物发酵起着重要的作用,搅拌速度、通气量是影响溶解氧浓度的重要因素[41,42]。陈凤美等[43]研究发现搅拌转速和通气量影响灰树花多糖组成及相关酶活性;黄开明等[44]通过试验发现对青贮玉米秸秆采用曝气水解时,将搅拌转速控制为100 r/min,溶氧量为2 mL/L时,木质纤维素的降解率可达48%;谢益晖等[45]认为搅拌转速较通气量对氧传质效率的影响更大;李静等[46]通过研究通气量对有机液肥好氧发酵的影响,发现不同的通气比对有机液肥的养分含量有不同的影响,通气比为1 L/(min·L)(通气量/发酵液体积)时,有机液肥在发酵结束后N、P、K养分含量最高,是最佳有机液发酵的通气选择。
为促进有机液肥取得更好的发展和应用效果,轻简化、水肥一体化装备研发尤为重要。张勇等[47]研究发明了一种有机液肥加工装置,提高了液态肥的加工效率;李军等[48]研究发明了一种有机液肥充分搅拌装置,此装置能够有效的提高搅拌效果,加速有机液肥的形成;北京农业智能装备技术研究中心设计研发了有机栽培水肥一体化系统(国家发明专利:ZL201510106953.0),该系统集有机液肥发酵和自动灌溉于一体,省工、省时,能够在作物最需要养分的时期以最佳的养分含量和活性满足作物的生长需求,避免了使用商品有机液肥储存、搬运过程中养分损耗大的问题[49,50,51]

3 有机液肥的使用方法及应用效果

有机液肥可采用根部灌施、叶面喷施等方法用于农业生产,所含有机、无机营养能够直接被作物吸收利用。
有机液肥作为根部肥施用时,应与适当比例的水混合均匀避免烧坏秧苗,也可作为叶面肥喷施,及时的为作物生长补充营养,满足植物的营养需求[52]。通过有机液肥根施+叶面喷施的方法,可显著提高辣椒和番茄产量,增产幅度在10%以上;浇施、喷施蚯蚓有机液肥可使青菜株高、开展度、叶片数等农艺性状得到改善,同时单株重也得到提高,且浇施效果好于喷施;对双季稻采取根外喷施的方法可有效提高其成穗率、结实率[53,54,55]
在传统土壤表面使用过程中,有机液肥由于土面蒸发和土层过滤,有效养分被作物根系吸收都会降低。因此,可以距离作物根部10~20 cm,根部附近埋设长20~30 cm直径Ф25-45PVC管,根据作物不同可以埋设1~4根管,将有机液肥通过滴管进行浇灌,可有效减少有机液肥养分的丢失,提高有机液肥的养分利用率[56]
合理使用有机液肥在提高作物产量和增加经济效益方面发挥着重要作用。朱恩等[57]以常规施肥为对照,施用蚯蚓有机液肥,前期结合灌溉根部浇施1次+生长后期结合喷洒农药叶面喷施一次,产量、效益、土壤总菌数均得到显著提高,叶菜类增产750~3720 kg/hm2,效益增加5.98%,果菜类增产900~9750 kg/hm2,效益增加10.38%,土壤总菌数增加15.5%。吴治国等[58]以施沼液做底肥(重施沼液肥,不施农家肥,化肥较对照减半)与不施沼液肥(按种菜施肥标准使用农家肥和化肥)进行对比,发现使用有机液肥可有效提高大棚航天辣椒的产量,航天辣椒每公顷增产30.4%,效益增加33.8%,良好的应用效果表明有机液肥在农业生产中具有较好的应用价值和发展前景。邹贵武[59]等采用正交试验,研究发现赤霉素和氨基酸有机液肥联合喷施可增强三叶赤楠叶片抗性,延迟叶片衰老,氨基酸4 mL/L,赤霉素100 mL/L时效果最佳。

4 关于有机液肥在农业生产中应用的思考

当前,中国现代农业面临的主要挑战是既要增加作物产量,又要减少化肥和农药的使用,有机液肥在促进化肥减施、有机肥替代中发挥着重要的作用。有机液肥与固体肥相比易实现养分机械化调控,营养物质容易被吸收利用;但有机液肥的发展也存在一些问题,有机液肥微生物含量不稳定、活性物质容易丧失,不宜长期储存且搬运困难,与化肥相比具有养分含量低等缺点。为促进有机液肥发展浅谈几点建议:

4.1 加强有机肥与无机肥的合理配施,满足作物生长所需营养

充分考虑作物营养需求,提前了解有机物料的营养成分及特性,合理选取优质原料配制有机液肥,在原料处理后,养分不足时可以采用有机液肥与无机营养液合理配施,提高肥效,满足作物对养分的需求。探索有机液肥对果实品质影响的关键时期,优化有机液肥与无机营养液配施方案,在提高品质的同时确保产量不减。

4.2 坚持现配现用的原则,发挥有机液肥的作用

有机营养液肥效不稳定、成分不固定,活性物质容易丧失,所以要做到有机液肥发酵结束后及时应用,避免长期储存和搬运过程中活性养分的损耗,也同时避免周围环境的变化对有机营养液肥效及药效的影响。加大轻简化、自动化有机液肥发酵设备的研发,实现有机液肥“现用现配”,有机废弃物就地资源化处理和有机液肥可持续性生产。

4.3 加强有机液肥的生物活性物质特性研究,优化施肥方案

有机物料所含养分各异,有机液肥配制过程中应对营养元素、活性物质、功能微生物进行评估,加强对不同种类有机液肥生物活性物质的研究。坚持多种肥源共用的原则,分析有机液肥与作物增效防疫的关联性,建立基于不同有机液肥养分释放、增效防疫的技术体系。

4.4 加强有机液肥的使用宣传,多头并举促进有机液肥的生产应用

有机液肥集“肥效、药效”于一体,合理施用可有效提高果蔬的产量和品质,减少病虫害的发生,符合现代农业发展方向。主管部门和农技人员应做好宣传,加强引导,开展专题培训,加强农民对经济效益、食品安全、生态环境相互关系的全面认识,多头并举促进有机液肥的生产与应用。

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