Antibacterial and Antioxidant Effects of Ultrasound Extract of Glycyrrhiza uralensis

Li Wenfen, Sun Ruige, Wang Bo

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Chinese Agricultural Science Bulletin ›› 2020, Vol. 36 ›› Issue (35) : 123-126. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb20191200967

Antibacterial and Antioxidant Effects of Ultrasound Extract of Glycyrrhiza uralensis

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Abstract

To find a safe food preservative, this study explored the antibacterial and antioxidant effects of Glycyrrhiza ultrasonic extract. Experiments with Escherichia coli and Bacillus subtilis were made to determine the radius of bacteriostatic circle by agar diffusion method. Antioxidant activity (DPPH scavenging ability and anti-O-phenylene three phenol self-oxidation) of each sample were investigated. Under the effect of Glycyrrhiza extract, the inhibition circle radius of E. coli reached 1.01 ± 0.08 cm, and the inhibition circle radius of B. subtilis reached 0.96 ± 0.03 cm after 18 hours of culture. Also, the free radical scavenging ability to DPPH was 93.1%, which was significantly higher than that of the control group (0.1mg/ml vitamin C). The highest anti-O-phenylene three phenol self-oxidation effect was 87.57%. In general, the extract of Glycyrrhiza uralensis has good antibacterial effect on the above two kinds of bacteria, and has certain antioxidant effect on DPPH and O-phenylene three phenol.

Key words

Glycyrrhiza uralensis Fisch / ultrasound extract / antibacterial activity / antioxidant

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Li Wenfen , Sun Ruige , Wang Bo. Antibacterial and Antioxidant Effects of Ultrasound Extract of Glycyrrhiza uralensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2020, 36(35): 123-126 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb20191200967

0 前言

目前,人工开发的抗氧化剂和杀菌剂已广泛用于防止食物腐败和杀灭病原菌,但大量使用会引起许多副作用,例如耐药菌株的出现和消化道菌群的改变等,因此,开发更安全的纯天然植物提取液来生产抗菌防腐产品刻不容缓。
甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是重要的药用植物[1],其主要化学成分有甘草甜素、黄酮、多糖等[2]。研究证实,甘草提取物具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗糖尿病和免疫调节等作用[3,4],甘草提取液对牙周致病菌的抑菌效果,与其在肉制品保鲜的抗氧化作用更是成为实验研究的重中之重,为进一步通过纯天然植物提取液来生产天然抗菌防腐产品提供了理论基础,测定甘草提取液的抑菌抗氧化效果迫在眉睫。
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌是常用的抑菌效果测试菌种[5],采取琼脂扩散法测定抑菌圈直径可检测抑菌活性。DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基有单电子,其在517 nm处有最大吸收峰[6]。抗氧化物质能使单电子配对,从而使吸光值降低[7],这一原理广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力[8]。邻苯三酚能迅速自氧化[9],其速率与生成O2-的浓度呈正相关,抗氧化剂能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2从而阻止了中间产物的积累,故可通过紫外可见光分光光度法来测定抗氧化剂的抗氧化能力[10]。文献显示,多种酚类和黄酮类化合物兼具抗氧化和抑菌双重作用[11],甘草中含多种化学成分,例如甘草酸、甘草甙、甘草黄酮等[12],因此有必要对其超声提取物抑菌、抗氧化活性进行定量分析。

1 实验材料与实验步骤

1.1 实验材料

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。实验于2019年2—5月在北京师范大学珠海分校生物技术实验室进行。

1.2 实验步骤

1.2.1 超声提取甘草提取液 甘草12.0043 g,粉碎后加入100 mL 60%乙醇[14],60℃、20 kHz超声波细胞粉碎仪提取20 min,过滤,定容至100 mL。
1.2.2 甘草提取液的抑菌效果研究
（1）菌株复苏及活化
冻干菌种溶解成悬浊液,接种至营养琼脂培养基,于37℃培养48 h,转至营养肉汤培养基中培养,振摇培养24 h(37℃, 200 r/min)[13,14]。
（2）抑菌活性检测
采用琼脂扩散法测定各萃取部位抑菌圈半径(IZD)[15]。将超声提取的甘草提取液稀释成4个浓度梯度(100%、90%、80%、70%),每组3个平行,吸取200 μL甘草提取液到牛津杯,60%乙醇溶液为空白对照,同体积的100 mg/mL青霉素为阳性对照,37℃恒温培养18 h后,在第1、2、3、4、5、6 h分别取样观察抑菌情况。
1.2.3 甘草提取液的抗氧化效果研究
（1）DPPH自由基清除能力测定[16,17]
对照组加入1 mL 75%乙醇,实验组用150 μL甘草提取液与850 μL 75%乙醇代替,0.2 mL 0.1 mg/mL的维生素C作为阳性对照溶液[17]。
（2）邻苯三酚自氧法测抗氧化效果
检测邻苯三酚自氧化速率[18]与不同浓度的甘草提取液阻止邻苯三酚自氧化反应在325 nm处的吸光度A,实验重复三次。

1.3 数据分析

数据采用SPSS 16.0进行显著性分析。

2 实验结果

2.1 甘草提取液对大肠杆菌抑制效果研究

表1可知,SPSS进行K-S正态检验,大肠杆菌在培养18 h后,1~6 h抑菌圈数据符合正态分布,方差齐性检验和单因素方差分析可知实验组甘草提取液对大肠杆菌有显著的抑制效果,90%甘草提取液与青霉素所展现的抑菌效果相当(P>0.05)。甘草提取液原液恒温培养18 h后,1~6 h期间抑菌圈半径比青霉素所展现的抑菌圈半径大(P<0.05),如1 h所测得的甘草提取液原液抑菌圈半径为0.98±0.03 cm,青霉素抑菌圈半径仅为0.67±0.06 cm,甘草提取液原液抑菌圈半径最大可达1.01±0.08 cm,而阳性对照组抑菌圈半径最大值仅为0.82±0.05 cm。4种浓度的实验组中,不同梯度抑菌圈直径差异显著,抑菌效果随甘草提取液成分浓度提高而增强,说明甘草提取液中有能明显抑制大肠杆菌繁殖的成分。
表1 大肠杆菌抑菌圈变化情况 cm
培养18 h后的
时间点		 青霉素
（阳性对照组）		 甘草提取液
原液		 90%甘草
提取液		 80%甘草
提取液		 70%甘草
提取液
1 h 0.67±0.06b 0.98±0.03a 0.73±0.05b 0.55±0.03c 0.34±0.03d
2 h 0.71±0.06b 1.00±0.08a 0.77±0.04b 0.57±0.03c 0.37±0.02d
3 h 0.75±0.06b 1.01±0.08a 0.80±0.04b 0.60±0.04c 0.41±0.03d
4 h 0.78±0.05b 1.01±0.06a 0.82±0.02b 0.63±0.03c 0.45±0.04d
5 h 0.81±0.06b 1.00±0.04a 0.84±0.05b 0.66±0.03c 0.48±0.02d
6 h 0.82±0.05b 0.98±0.06a 0.85±0.04b 0.68±0.03c 0.50±0.04d
注：不同字母表示同列数据间差异显著(P>0.05),下同。

2.2 甘草提取液对枯草芽孢杆菌抑制效果研究

由表2可知,甘草提取液对枯草芽孢杆菌的抑制效果与对大肠杆菌的抑制效果类似,恒温培养18 h后,1~6 h期间都有较强的抑菌效果,甘草提取液原液抑菌圈直径显著大于青霉素的抑菌圈直径,甘草提取液原液抑菌圈直径最高可达0.96±0.03 cm,而青霉素的抑菌圈直径最大仅有0.81±0.04 cm,但从1~6 h的趋势来看,青霉素的抑菌效果仍然在稳步提升（可通过抑菌圈半径逐步增加体现）,而甘草提取液原液的抑菌效果趋于平缓。
表2 枯草芽孢杆菌抑菌圈变化情况 cm
培养18 h后的时间点 青霉素（阳性对照组） 甘草提取液原液 90%甘草提取液 80%甘草提取液 70%甘草提取液
1 h 0.48±0.06c 0.92±0.02a 0.70±0.05b 0.47±0.02c 0.23±0.02d
2 h 0.65±0.02c 0.95±0.04a 0.72±0.02b 0.53±0.02d 0.34±0.03e
3 h 0.71±0.04b 0.95±0.05a 0.73±0.04b 0.58±0.03c 0.38±0.02d
4 h 0.75±0.04b 0.96±0.03a 0.74±0.05b 0.59±0.03c 0.41±0.04d
5 h 0.78±0.04b 0.95±0.03a 0.75±0.04b 0.60±0.04c 0.43±0.02d
6 h 0.81±0.04b 0.94±0.03a 0.76±0.03c 0.62±0.02d 0.45±0.04e

2.3 DPPH自由基清除能力测抗氧化效果的实验结果分析

从表3可以看出,4个实验组浓度的甘草提取液均具有DPPH自由基清除作用,其清除能力与浓度呈明显的正相关,清除效果随着甘草提取液浓度的增加而增强。0.1 mg/mL维生素C清除DPPH自由基的能力显著低于甘草提取液原液及90%甘草提取液的清除能力,分别是93.10%与89.10%。当甘草提取液浓度为80%时,其清除率为84.60%,与浓度为0.1 mg/mL维生素C清除率相当,无显著差异。
表3 不同浓度甘草提取液DPPH自由基清除能力
维生素C 甘草提取液原液 90%甘草提取液 80%甘草提取液 70%甘草提取液
84.8%±0.2%c 93.1%±0.5%a 89.1%±0.5%b 84.6%±0.6%c 74.4%±8.9%d

2.4 邻苯三酚自氧法测抗氧化效果的实验结果分析

从表4得知,甘草提取液的浓度与邻苯三酚自氧化清除率呈明显的正相关关系,清除效果随着甘草提取液浓度的降低,呈现梯度下降的趋势。甘草提取液原液邻苯三酚的自氧化清除率显著高于其他实验组,达到87.57%,当甘草提取液浓度稀释至70%时,邻苯三酚自氧化清除率下降到53.03%。
表4 不同浓度甘草提取液抗邻苯三酚自氧化清除率
甘草提取液原液 90%甘草提取液 80%甘草提取液 70%甘草提取液
87.57%±4.08%a 78.18%±3.93%b 68.79%±3.81%c 53.03%±2.14%d

3 讨论

从两组抑菌实验可以看出,其中空白对照组均未产生抑菌作用,而甘草提取液抑菌圈半径随浓度升高而扩大,这些结果表明甘草提取液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌这2种受试菌株都具有较好的抑制和杀灭效果,杨硕等[19]的实验结果也证实了甘草提取液对金黄葡萄球菌和白葡萄球菌有较好的抑菌效果,可知甘草提取物中存在对大肠杆菌生物膜有抑制作用的成分[20],分析甘草提取物其主要成分包括甘草酸[21]、甘草次酸[22]、甘草类黄酮等的混合物,其中甘草酸具有抗菌和抗病毒作用[2]。
对于常用的抗氧化效果测定对象DPPH与邻苯三酚,甘草提取物对其也有一定的抗氧化效果。实验结果表明,当甘草提取液浓度为80%时,其对DPPH自由基清除能力和阳性对照组维生素C相当（无显著差异）,但随着甘草提取液浓度提高,其清除能力增强,显著高于对照组。邻苯三酚自氧化实验结果也可以看出,甘草提取液原液对邻苯三酚的自氧化清除率最高可达到87.57%,这主要是由于甘草中含有的黄酮类化合物[23]、甘草苷[24]、多糖化合物[25,26]等有效成分,具有较强的抗氧化作用。
甘草是一种重要的药用植物,长期以来被用于治疗世界各地的多种疾病[27]。目前,利用水提[28]、醇提、萃取[29]等方式进行有效成分提取已有相关报道,而本研究采用超声提取方式,通过产生热效应以及机械剪切作用,有助于物质在溶剂中的扩散和溶解,具有缩短提取时间、无其他溶剂干扰、提取效率高的优点[30],得到的甘草提取液经实验证实具有较好的抑菌和抗氧化效果,可以为开发纯天然植物提取液抗菌防腐产品提供参考数据,后续可以进一步研究甘草提取液对霉菌等的影响,更好地开发生物保鲜剂。

4 结论

利用超声法得到的甘草提取液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有较好的抑制作用,其抑菌圈半径在培养18 h后分别可以达到1.01±0.08 cm、0.96±0.03 cm;抗氧化效果方面,甘草提取液对DPPH的自由基清除能力最高可达到为93.1%,抗邻苯三酚的自氧化效果最高可达到87.57%。

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CONTEXT: Calcineurin (CN), a unique protein phosphatase, plays an important role in immune regulation. Our laboratory has established an effective molecular drug-screening model based on CN activity. OBJECTIVE: Our aim is to search for an effective immunosuppressant from Glycyrrhiza uralensis (Leguminosae). MATERIALS AND METHODS: As guided by CN inhibitory test, an active compound was purified and identified as glycyrol. Immunosuppressive activity of glycyrol in vitro was assayed by T lymphocytes proliferation and mixed lymphocyte reaction (MLR). In addition, delayed-type hypersensitivity reaction (DTH) and skin allograft test in vivo were also carried out. Further, we have investigated the effect of glycyrol on phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)/ionomycin (Io)-stimulated IL-2 expression in Jurkat cells. RESULTS: The enzymatic assay showed glycyrol (IC(50) = 84.6 muM) inhibited calcineurin activity in a dose-dependent manner. Glycyrol, at the non-cytotoxic concentration, significantly inhibited proliferation of murine spleen T lymphocytes induced by Concanavalin A (Con A) and mixed lymphocyte reaction (MLR) in vitro. In addition, mice treated with glycyrol had shown the dose-dependent decrease in delayed type hypersensitivity (DTH) and prolonged the graft survival by 59% compared to the control group (*p < 0.05). RT-PCR showed glycyrol suppressed IL-2 production in a concentration-dependent manner. DISCUSSION AND CONCLUSION: Our results show the immunosuppressive activity of glycyrol and this activity should be due to its inhibitory effect on CN activity, thereby suppressing IL-2 production and regulating T lymphocytes. Thus, glycyrol could be a candidate for development as a novel immunomodulatory drug.
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