A Pathogen from Grass Carp with Hepatobiliary Syndrome Complicated with Bacterial Disease: Isolation, Identification and Drug Susceptibility Test

Rao Yi, Fu Huiyun, Chen Wenjing, Huang Jiangfeng, Zhou Zhiyong, Jin Youping, Xu Xiandong

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Chinese Agricultural Science Bulletin ›› 2020, Vol. 36 ›› Issue (5) : 138-143. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb18120095

A Pathogen from Grass Carp with Hepatobiliary Syndrome Complicated with Bacterial Disease: Isolation, Identification and Drug Susceptibility Test

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Abstract

The pathogen identification and drug susceptibility test were performed on grass carp (Ctenopharyngodon idellus) that suffered from an acute disease in a fish farm in Gaojialing town, Poyang County, Jiangxi Province in June 2016. The aim was to determine and identify the cause of death and provide reference for effective prevention and control of the disease in future. The pathogenic bacteria were isolated and purified from grass carp with hepatobiliary syndrome by bacterial isolation method under aseptic condition. The morphological, biochemical analysis, 16S rDNA sequence analysis and gyrB sequence analysis were used to identify the strains, and the challenge test was conducted to obtain LD50 of grass carp. The drug susceptibility test was conducted by a filter paper diffusion method. The results showed that a pathogenic bacteria strain was isolated from grass carp. The pathogen was identified as Aeromonas veronii, called PYG1. PYG1 could infect grass fish, and the LD50 was 1.5×10 4CFU/g. The drug susceptibility test showed that the strain was susceptible or moderately susceptible to 9 kinds of drugs, including aminoglycosides, second-generation and third-generation cephalosporins and ofloxacin, and was resistant to other drugs tested, and was a strongly resistant strain. In conclusion, the pathogen of grass carp is A. veronii PYG1, which could be controlled with aminoglycosides, cephalosporins and quinolones.

Key words

grass carp / hepatobiliary syndrome / Aeromonas veronii / isolation and identification / drug susceptibility test

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Rao Yi , Fu Huiyun , Chen Wenjing , Huang Jiangfeng , Zhou Zhiyong , Jin Youping , Xu Xiandong. A Pathogen from Grass Carp with Hepatobiliary Syndrome Complicated with Bacterial Disease: Isolation, Identification and Drug Susceptibility Test. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2020, 36(5): 138-143 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb18120095

0 引言

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是江西省水产养殖主养品种,养殖产量占全省总水产养殖产量20%左右,已发展了池塘精养、围栏养殖、大水面湖泊养殖等多种养殖模式,为江西省水产品市场提供了价格实惠,质量优良的蛋白质来源[1]。然而随着草鱼养殖规模的无序扩大、养殖密度的增加,超出养殖容量,导致养殖水质变坏,草鱼疾病,特别是细菌性疾病暴发日益严重。据报道,2015年在南昌等10余个地市监测到的细菌性疾病占46.2%,已成草鱼养殖业健康可持续发展的制约因素[2]。在实际生产中通常使用疫苗和抗菌药物来控制和治疗细菌性疾病。但最近几年养殖户普遍反映使用疫苗的效果变差甚至没有效果,邓国成等[3]在广东、福建等地取样检测认为所检测的草鱼病鱼样品中存在病毒和嗜水气单胞菌合并感染的情况,而且嗜水气单胞菌在不同的地区存在不同的分型,因此要加强当地草鱼病原的流行病学调查,以确定引起草鱼发生疾病的病原。在使用抗菌药物治疗方面也存在因用药不科学而造成不断出现耐药菌的情况,张晓燕等[4]对分离自江西省的26株嗜水气单胞菌进行药敏测试发现耐药性问题已非常严峻,而且不同地区的菌株对药物的敏感性差异较大,因此要加强细菌的药物敏感性监测,做到合理用药。虽然近年来各地加强了对当地草鱼病害的监测,但对草鱼细菌性疾病病原鉴定及药敏性测试报道的还较少。2016年6月,江西省鄱阳县高家岭一草鱼养殖场暴发疾病,发病症状主要为尾鳍发白,部分发病鱼解剖可见胆汁浸染肝脏,造成肝脏发绿。养殖湖泊面积13.33 hm2,持续多日都可见草鱼每天死亡几十上百尾。本研究对发病草鱼进行了病原分离鉴定及药敏测试,为丰富江西地区草鱼病原流行病学资料及病害防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

患病草鱼采样自江西省鄱阳县高家岭镇草鱼养殖场,病鱼体质量80~100 g,体长(15±2) cm,其主要患病症状为尾鳍发白,腹部有充血点,发病鱼解剖发现肝脏胆汁浸润发绿。感染试验所需健康草鱼,由江西省水产科学研究所提供,体质量100 g左右,无患病史。实验所需引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;细菌DNA提取试剂盒购自大连宝生物公司;细菌生化鉴定管、药敏纸片及相关试剂购自杭州微生物有限公司。

1.2 病原菌分离

无菌操作取患病草鱼肝脏、脾脏、肾等组织,分别接种于普通营养琼脂培养基,28℃培养24 h。根据菌落形态、大小等特征分类,取优势菌株以普通营养琼脂培养基纯化2次后,斜面保存备用。同时将优势菌株培养液与等体积50%甘油混合,于-80℃冰箱中长期保存备用。

1.3 人工感染实验

健康草鱼暂养7天后,每10尾为一组,放于 100 cm × 60 cm × 60 cm的玻璃缸中,水深维持在 40 cm,每组设置一个重复。每天上午投喂草鱼配合饲料一次,投喂量为鱼体质量的2%,没天换水1/3,充气养殖。从患病草鱼分离的优势菌株经扩大培养后,用无菌生理盐水配制1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108 CFU/mL的菌悬液,分别腹腔注射接种于健康草鱼（0.2 mL/尾）,对照组腹腔注射等量无菌生理盐水。记录感染后7天内各组草鱼的发病及死亡情况,并从感染患病个体肝脏等部位再次进行细菌分离,根据柯赫法则确定病原菌,以25%甘油于-80℃保存。用BLISS法测定病原菌株对健康草鱼的LD50值。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 生理生化鉴定 病原菌经纯化后,参照东秀珠等[5]的方法进行形态学和生理生化鉴定。
1.4.2 16S rDNA序列测定与分析 16S rDNA序列PCR扩增和克隆转化参照徐先栋等[6]的方法进行,阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。采用MEGA 6.06版软件将测序结果与从GenBank中获得的同源性最高的细菌16S rDNA序列进行多序列匹配排列,构建Neibor-Joining系统进化树,Bootstraps重复检验次数设置为1000,初步鉴定病原菌种类。
1.4.3 gyrB基因序列测定与分析 根据16S rDNA分析结果,参照张旭杰等[7]方法对病原菌株进行gyrB基因序列同源性分析,进一步鉴定病原菌。gyrB基因引物序列为gyrB3F (5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT- 3′),gyrB14R(5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′)。PCR反应体系为25 μL,分别含有10×Ex Taq Buffer 2.5 μL;MgCl2 (25 mmol/L) 2.5 μL;dNTPs (each 2.5 mmol/L) 2 μL;上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL;模板DNA 1 μL;TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL以及14.8 μL ddH2O。PCR反应参数设置为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸90 s,共30个循环;最后72℃延伸10 min。参照本研究1.4.2的方法克隆测序以及构建系统进化树。

1.5 药敏试验

选取10类33种抗生素药敏纸片,分别检测抑菌圈直径,根据敏感性标准确定各种药物对病原菌株的敏感性。

2 结果与分析

2.1 病原分离及LD50的测定

从患病草鱼肝、脾、肾等部位均分离到菌落形态一致优势菌,菌落呈淡黄色,边缘整齐、湿润、突起,选取肝脏的优势菌经纯化后保存,命名为PYG1。不同浓度PYG1菌液对草鱼人工感染结果表明（表1）,菌液浓度为1.5×108 CFU/mL时,草鱼感染后活力减弱,感染2天后全部死亡,死亡率达100%;菌液浓度为1.5× 104 CFU/mL时,草鱼感染后7天内未出现死亡;其他各组感染7天内的死亡率由高到低分别为70%、50%、30%,对照组实验草鱼正常,未出现死亡。经BLISS方法计算菌株PYG1对草鱼的LD50值为：LD50=1.5×106 CFU/mL,按平均鱼体质量100 g换算,LD50值记为1.5×104 CFU/g鱼体质量。
表1 菌株PYG1对草鱼的人工感染结果
菌液浓度/(CFU/mL) 感染剂量/mL 感染浓度/(CFU/tail) 感染数量/尾 死亡数量/尾 死亡率/%
1.5×108 0.2 3×107 10×2 20 100
1.5×107 0.2 3×106 10×2 14 70
1.5×106 0.2 3×105 10×2 10 50
1.5×105 0.2 3×104 10×2 6 30
1.5×104 0.2 3×103 10×2 0 0
对照control 0.2 0 10×2 0 0

2.2 生理生化鉴定

选取18种生理生化指标对病原菌株PYG1进行生理生化测定,结果表明（表2）,菌株PYG1各项生化指标同《常见细菌系统鉴定手册》[2]中描述的维氏气单胞菌的特征一致,初步判断该病原菌株为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。
表2 病原菌株PYG1生理生化特征
项目 菌株PYG1 维氏气单胞菌 项目 菌株PYG1 维氏气单胞菌
革兰氏染色 - - 产氨Ammonia production + +
接触酶 - - 水解脲素Hydrolyzed urea - -
氧化酶 + + 亚硝酸盐Nitrite - -
吲哚 + + 反硝化Denitrification - -
甲基红 - - 硝酸盐还原Nitrate reduction + +
七叶苷水解 + + 蔗糖Sucrose + +
硫化氢 - - 葡萄糖发酵Glucose ferment + +
VP test + + 明胶液化Gelaune liquefaction + +
水杨苷发酵 + + 甘露醇Mannitol + +
注：+表示阳性;-表示阴性。

2.3 16S rDNA 基因同源性分析

病原菌PYG1所扩增的16S rDNA 基因序列长度约为1500 bp,对其测序并提交至GenBank核酸序列数据库,登录号为KY767544。以NCBI的Blast检索系统对其进行序列同源性分析,构建系统进化树,结果表明（图1）,该菌株与气单胞菌属细菌自然聚类,并与检索出的维氏气单胞菌聚为一支,与标准菌株(ATCC 35624)相似性达99%。
图1 Neibor-Joining法构建的气单胞菌属16S rDNA序列系统进化树
数值为自举值,括号内为菌株的GenBank登录号,下同

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2.4 gyrB基因序列同源性分析

病原菌PYG1所扩增的gyrB基因序列长度为1123 bp。将该序列以NCBI的Blast检索系统分析并构建系统发育树,结果表明（图2）,菌株PYG1的gyrB基因序列与气单胞菌属细菌自然聚类,与维氏气单胞菌(ATCC 35624)聚为一大支。综合病原菌株PYG1的表型特征、理化特性及16S rDNA和gyrB基因序列分析结果,判定其为气单胞菌属(Aeromonas)的维氏气单胞菌。
图2 N-J法的气单胞菌属gyrB基因序列系统进化树

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2.5 药敏检测

药敏实验结果表明（表3）,该病原菌株只对氨基糖苷类,第二代和第三代头孢类以及喹诺酮类的氧氟沙星共9种药物表现出敏感或中度敏感,对所测的其他24种药物则全部耐药。
表3 病原菌PYG1对33种抗菌药物的敏感性
药物类别 药物名称 抑菌圈直径/mm 敏感性 药物类别 药物名称 抑菌圈直径/mm 敏感性
青霉素类 青霉素 0 R 头孢类 头孢氨苄1 0 R
氨苄青霉素 0 R 头孢拉定1 11 R
羧苄西林 0 R 头孢呋肟2 19 I
苯唑西林 0 R 头孢哌酮3 12 R
哌拉西林 0 R 头孢曲松3 35 S
酰胺醇类 氯霉素 11 R 头孢唑啉1 13 R
氟苯尼考 0 R 头孢他啶3 22 S
氨基糖苷类 丁胺卡那霉素 20 S 大环内酯类 红霉素 11 R
卡那霉素 15 I 麦迪霉素 11 R
庆大霉素 16 S 多肽类 万古霉素 0 R
新霉素 16 I 多粘菌素 0 R
四环素类 四环素 0 R 喹诺酮类 环丙沙星 10 R
强力霉素 9 R 氧氟沙星 15 I
美满霉素 15 I 诺氟沙星 0 R
硝基呋喃类 呋喃唑酮 13 R 恩诺沙星 12 R
磺胺类 复方新诺明 0 R 左氧氟沙 13 R
林可酰胺 克林霉素 0 R
注：S表示敏感,I表示中度敏感,“R”耐药;上标1、2、3分别表示第一、第二、第三代头孢类抗生素。

3 讨论与结论

草鱼肝胆综合症以肝胆肿大、变色为典型症状[8]。肝脏变绿主要原因是肝胰腺分泌的胆汁淤滞在肝组织中出现的,一般报道原因多为饲料不适或滥用药物引起[9,10,11]。与肝脏正常草鱼相比,肝脏外观产生变异草鱼的肝脏有不同程度的损伤,同时免疫系统也受到破坏[12]。因此,患肝胆综合症草鱼免疫力低下,容易与细菌性疾病并发,引起养殖草鱼死亡[13]。维氏气单胞菌是养殖环境中常见细菌,常造成养殖鱼、虾、蟹等多种水产动物致病,典型症状为体表溃疡、红点、出血等[14,15,16],有报道从养殖水体、鱼体分离的气单胞菌多为维氏气单胞菌[17,18],笔者近几年从江西省水产养殖系统中分离细菌也证实这点,分离的气单胞菌株多为维氏气单胞菌,表明维氏气单胞菌可能也是近期江西地区流行的病原菌。这可能是造成近年来江西地区草鱼疫苗效果不佳的原因之一,因为目前只有草鱼出血病病毒疫苗和鱼嗜水气单胞菌疫苗有生产批文可用于鱼苗注射,下一步需要加强对维氏气单胞菌的流行病学调查,为研制鱼维氏气单胞菌疫苗以控制其引起的细菌性疾病打好基础。
细菌生化鉴定可初步鉴定到属,精确的鉴定,需借助细菌保守基因的测序鉴定。一般常用的基因为16SrDNA,但在气单胞菌属细菌的鉴定上,特别是维氏气单胞菌基因组中含有6个16S rRNA基因拷贝,每个拷贝之间基因序列存在多达1.5%的差别[19],使得应用16S rDNA基因序列鉴定维氏气单胞菌存在不准确性,往往在不同细菌之间出现混淆,如本研究中16SrDNA系统树存在不同菌株聚在同一分支上。对维氏气单胞菌的鉴定应借助其他的保守基因进一步确定细菌的种类。gyrB基因是比16SrDNA更为保守的基因,长度约为1.2k~1.4 kb,适合进行信息学分析,应用gyrB基因能更好的区分气单胞菌属中各种类细菌[20]。本文中应用gyrB基因聚类分析,发现本研究分离的菌株PYG1的gyrB基因序列与维氏气单胞菌(ATCC 35624)聚为一大支,因此判定其为气单胞菌属(Aeromonas)的维氏气单胞菌。
本研究分离的维氏气单胞菌株耐药性强,仅对氨基糖苷类、第三代头孢类、四环素类的美满霉素、喹诺酮类的氧氟沙星敏感或中度敏感。菌株耐药性同其他研究者报道不近相同,表明维氏气单胞菌株的耐药性是可以变化的,也即表明维氏气单胞菌可以在抗生素选择压力下获得耐药性。喹诺酮类药物是防治维氏气单胞菌较好的药物[21],笔者在南昌周边池塘养殖草鱼体内分及在抚州市东乡区台湾泥鳅体内分离的维氏气单胞菌均表现对喹诺酮类药物敏感也证实这点[16],不过本研究分离的菌株,可能是由于大量的盲目使用喹诺酮类药物,从而因选择压力产生了针对喹诺酮类药物的获得性耐药性,可见在疾病防治上不能滥用,要合理的,科学的使用抗生素,减少耐药性产生。
本研究结果表明,维氏气单胞菌是引起此次草鱼发病的致病菌,LD50值为1.5×106 CFU/mL,有较强致病性,可选用氨基糖苷类、头孢类及喹诺酮类的氧氟沙星等药物进行防治。

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