中国农学通报 2020,36(10):69-78
0 引言
莲是莲科(Nelumbonaceae)莲属(
Nelumbo)的多年水生植物,尽管化石种较多
[1],但现存活植物仅亚洲莲(
Nelumbo nucifera)和美洲莲(
N. lutea)2种,前者分布于亚洲和北澳大利亚,后者产于北美和南美
[2]。莲在中国的栽培利用历史悠久,是集观赏、食用、药用及净化水体等多功能于一身的重要水生植物,经济和文化价值极高。莲的繁殖方式包含有性(种子)、无性(种藕或藕芽、组培)2种方式。在农业生产实践和园艺应用中,种藕繁殖为使用最为广泛的模式;但此方式严重受限于自然生长周期短所限,繁殖系数低,品质无法维持长期稳定,生产成本高(场地设施、人力成本),储存及运输亦十分不便。目前,在莲新品种选育中,利用现代分子育种技术进行特定优良性状的改良是有效途径之一,但这需要大量的、品质一致的转化材料的全年供应。离体快繁技术在一定程度上能缓解和克服这些问题
[3]。莲离体快繁技术在20世纪80年代已有报道,先后使用藕芽和莲子(莲胚)为外植体的研究逐渐开展。早期,李良俊等
[4]使用藕莲品种‘美人红’的藕芽为外植体初步摸索了莲的组织培养技术;之后,于文进等
[5]、柯卫东
[6]、罗丽萍等
[7]、刁英等
[8]也相继以藕芽为材料对莲组培快繁技术展开了研究。除藕芽外,莲子(莲胚)也是莲离体培养常用的重要外植体。以授粉后不同时期美洲莲的莲胚进行离体培养,柯善强等
[9]得到授粉7天后幼胚诱导形成的完整植株。在不加任何激素的条件下,张建福和王锋
[10]将20~30天的莲胚离体诱导也获得了植株。郑丽
[11]发现携带子叶的莲胚在离体培养过程中萌发率高于去除子叶的莲胚,并发现莲子灭菌、浸泡催芽后剥去莲胚有利于初代培养。这些研究表明,莲胚离体诱导技术日趋成熟
[12,13]。然而,无论藕芽还是莲子作为外植体建立莲离体无性系,均存在不同程度的外植体消毒不彻底的难题
[14,15]。为提高外植体消毒效果,孔德政等
[16]使用浓硫酸处理莲子,但组培后期的植物长势弱;徐君等
[17]延长氯化汞消毒时间获得的无菌藕芽后期常伴随内生菌污染;使用先破壳后次氯酸钠消毒的模式处理莲子,蔡颖欣等
[13]实现了零污染率,但苗子长势也较弱。为解决莲外植体消毒效果不佳,了解离体培养下不同品种长势差异大的问题,笔者以全球不同种源地的野生型莲自交种子为试验材料,以成熟莲子的胚作为外植体,拟建立一套相对成熟的无菌莲胚消毒体系;并通过比较不同种源地莲胚离体生长表现差异,筛选构建和优化莲的高效快繁体系,为后期愈伤组织的诱导和遗传转化体系的建立打好基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料和试剂
试验材料为9个不同种源地的野生型莲(图1),包括亚洲莲的中国野生莲黑龙江莲、白洋淀红莲、微山湖红莲和普兰店古莲,泰国莲,越南莲,印度莲,澳大利亚莲;来源美国的美洲莲(表1)。上述资源均保存于上海辰山植物园的国际荷花资源圃,经过2016年及2017年人工授粉获得自交莲子,自然干燥后每个种源地的莲挑选8~10粒健壮、饱满种子进行试验,其中澳大利亚莲4粒莲子(数量少,后期培养数据未进行分析)。试验于2018年3—8月在中国科学院上海辰山植物园科研中心观赏植物资源与种质创创新利用课题组实验室进行。基本培养基(Murashige and Skoog basal medium,MS)、植物凝胶(Phytagel)、植物激素萘乙酸(α-naphthaleneacetic acid,NAA)、激动素(Kinetin,KT)等购自Sigma公司;植物保护混合剂(Plant preservative mixture,PPM)购自北京启维易成科技有限公司;酒精购自上海泰坦有限公司;其他试剂购于上海生工生物和北京国药集团。
图1 9个不同种源地的野生型莲花特征PLD.普兰店古莲,HLJ.黑龙江莲,BYD.白洋淀红莲,WSH.微山湖红莲,VN.越南莲,TH.泰国莲,IN.印度莲,AU.澳大利亚莲,NLU.美洲莲 |
Full size|PPT slide
编号 | 代表种源名 | 种名 | 原产地 | 生态型 | 株型 | 花色 | 瓣型 | 凭证标本/栽培号 |
中文名 | 拉丁文 |
PLD | 普兰店古莲 | 亚洲莲 | Nelumbo nucifera | 中国辽宁大连普兰店区 | 温带型 | 大型 | 红色 | 单瓣 | M385 |
HLJ | 黑龙江莲 | 亚洲莲 | N. nucifera | 中国黑龙江挠力河 | 温带型 | 大型 | 红色 | 单瓣 | M474 |
BYD | 白洋淀红莲 | 亚洲莲 | N. nucifera | 中国河北新安县白洋淀 | 温带型 | 大型 | 红色 | 单瓣 | M282 |
WSH | 微山湖红莲 | 亚洲莲 | N. nucifera | 中国山东滕州市微山湖 | 温带型 | 大型 | 红色 | 单瓣 | TDK1036/M655 |
VN | 越南莲 | 亚洲莲 | N. nucifera | 越南海阳市 | 温带型 | 大型 | 粉色 | 单瓣 | TDK2914 |
TH | 泰国莲 | 亚洲莲 | N. nucifera | 泰国清迈Sarapee区11号公路旁 | 热带型 | 大型 | 白色 | 单瓣 | TDK2782/L140 |
IN | 印度莲 | 亚洲莲 | N. nucifera | 印度Maharashtra邦 | 温带型 | 大型 | 淡粉色 | 单瓣 | TDK1603/M469 |
AU | 澳大利亚莲 | 亚洲莲 | N. nucifera | 澳大利亚北部Mary River附近 | 热带型 | 大型 | 红色 | 单瓣 | L131 |
NLU | 美洲莲 | 美洲莲 | N. lutea | 美洲佛罗尼达迈阿密Okeechobee湖 | 温带型 | 大型 | 黄色 | 单瓣 | TDK642/M519 |
| 注:M、L开始编号的为荷花资源的栽培编号,TDK开始编号的为标本采集号。 |
1.2 试验器材
MGC-P系列光照培养箱,上海一恒科学仪器生产;VS-1300L-U洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司生产;TOMY SX-300高压蒸汽灭菌器,北京宏昌信科技生产;BSA224S电子分析天平,北京赛多利斯科学仪器生产;FiveEasy台式pH计,瑞士梅特勒生产。
1.3 无菌莲胚外植体的获得
用外壳消毒后直接剥取莲胚做外植体的方式易污染
[16]或褐化
[11]。针对此问题,本试验改良为结合植物保护混合剂(PPM)浸泡的4步消毒法:(1)将莲子用洗衣粉洗净冲洗后,再用75%酒精将莲子浸泡1 h、晾干;(2)在超净工作台内将莲子基部破壳,75%酒精灭菌1 min,无菌水冲洗3~4次;(3)催芽预培养:结合前期工作基础,先使用高浓度的2% PPM浸泡上述破壳莲子2 h,无菌水冲洗2~4遍,然后以不同低浓度PPM(0.01%、0.05%、0.1%)进行3~5天浸泡催芽(
表2);(4)上述浸泡莲子的绿色子叶长出后,在超净工作台中用镊子将2片白色胚乳剥开,取出带子叶的莲胚接种在初代培养基上。以2%次氯酸钠消毒但未增加PPM处理作为对照。
为获取最优的催芽预培养方法,先使用野生型莲白洋淀红莲的自然结实莲子进行上述处理(含对照)试验,每个处理20粒莲子。由此确定最佳处理PPM浓度后,再对9个不同种源地野生型莲的自交莲子进行消毒、催芽和莲胚的剥取,开展正式的比较试验。
1.4 初代培养和继代培养
1.4.1 初代培养 在超净工作台内,将上述预培养获得的莲子莲胚取出,切取其约0.5 cm上半部接种到初代培养基(MS+ 2 mg/L KT+ 0.1 mg/L NAA+ 3%蔗糖和4 g/L的植物凝胶,pH 5.8)上。此培养基为课题组前期试验筛选所得,适合多数莲品种。
1.4.2 继代培养 莲胚在初代培养基中培养到30~35天时,莲胚幼苗生长达最旺盛,而培养基中营养元素开始缺乏,此时需继代培养。将旺盛幼苗的每2个茎节剪切为1个单体,转移到继代生长培养基中,每瓶2个单体。继代培养基为MS+ 1.5 mg/L KT+ 0.1 mg/L NAA+3%蔗糖和4 g/L的植物凝胶,pH 5.8。
1.4.3 培养条件 人工培养箱中培养,光照时间16 h,光照时温度为28℃,光照强度为1500~2000 lx;黑暗培养时温度为24℃,时间为8 h。
1.5 组培苗形态指标的测量及分析
催芽时每天观察、记录试验材料莲子萌发情况,包括莲子果皮裂开程度、萌芽速度以及萌芽长度。初代培养期间前5天每天观察,记录莲胚的生长情况;每隔5天拍照每瓶材料,并统计部分指标。继代培养期间,间隔15天拍照和统计所有指标。
在初代培养0~20天期间,由于外植体数量有限以及避免反复取材测量而影响其正常生长,采取先对所有的离体幼苗隔瓶拍照后使用Photoshop软件测量、换算的策略。初代培养至30天时,在超净工作台中由组培瓶中取出全部的幼苗测量各指标,然后按1.4节进行继代培养。继代培养30天时,每个种源地的胚培养苗随机取5瓶,在瓶外测量各指标。具体指标及测量方法如下:叶数量为每个离体培养莲胚幼苗所有展开的叶数。叶大小测定参照国际莲属栽培品种登录表,面对荷叶,横向中轴线最长距离即长径,纵向垂直最短距离(纵向两端凹陷处之间距离)为短径。叶柄长度为叶柄基部到叶片基部的长度。叶柄粗度为叶柄基部的叶柄宽度。总根数量为每株幼苗所有茎节处的根数总和。短根数量为每株幼苗所有茎节处长度介于0~0.5 cm的根数。中根数量为长度介于0.5~1 cm的根数。长根数量为长度大于1 cm的根数。茎节间数量为每株幼苗伸长根状茎的节间总数。茎节间长度即每株幼苗生长出的根状茎的总长度除以其茎节间数量。茎节间粗度为所有节间的中间位置的粗度。将上述指标的测定值计算其均值,进行比较分析。
使用Excel和SPSS处理数据。SPSS 24方差分析的Duncan多重比较法进行相关数据的分析,采用隶属函数法
[18]对8个不同种源地的莲胚在不同生长时期的生长势进行综合评价。计算如式(1)。
式中,Uij(x)为莲材料i的指标j隶属值,Xij为莲材料i的指标j的测定值,Xjmin和Xjmax分别为j指标的最小测定值和最大测定值。先将各指标采用式(1)计算隶属值,然后求均值,即得到8个类型莲的总隶属函数均值。此均值越大,则表明该类型莲离体条件下幼苗的生长势越好。
2 结果与分析
2.1 催芽预培养对离体培养中莲胚污染状况的改善
以白洋淀红莲自然结实莲子为外植体,筛选整体消毒流程中的第3步催芽预培养的最佳处理。试验发现,其处理2(2%PPM消毒2 h后使用0.05%PPM浸泡5天)催芽效果最佳,无污染,莲胚萌发率最高(表2),且后期生长健壮,未出现褐化现象。反观对照1和对照2中氯化钠消毒+无菌水浸泡方式,在催芽过程中有浑浊现象,PPM浸泡液处理则未见此现象。此外,在后期培养基培养中,无菌水预培养的莲胚少数伴随内生菌出现,PPM预培养获得的莲胚则未出现此类污染。
方法 | 短时消毒步骤 | 长时催芽步骤 | 莲胚无菌率/% | 10 d莲胚正常生长率/% |
处理1 | 2% PPM × 2 h | 0.01% PPM × 5 d | 90 | 85 |
处理2 | 2% PPM × 2 h | 0.05% PPM × 5 d | 100 | 95 |
处理3 | 2% PPM × 2 h | 0.1% PPM × 5 d | 100 | 75 |
CK1 | 2% NaClO × 5 min | 无菌水× 5 d | 75 | 25 |
CK2 | 2% NaClO × 10 min | 无菌水× 5 d | 90 | 20 |
2.2 9个种源地的莲莲子催芽效果差异
根据2.1节结果,对9个种源地野生型莲的自交莲子消毒时,在第3步的催芽预培养中选择处理2(表2),浸泡5天后,均获得100%的无菌莲胚,再次验证了2% PPM × 2 h + 0.05% PPM浸泡的催芽预培养方法适用于无菌莲胚的获得。
在此催芽过程中,浸泡莲子1天时,果皮普遍从剪开口处轻度裂开,2天后普兰店古莲、印度莲、泰国莲和越南莲的大部分莲子果皮(各自所占比例8/10、6/8、6/8、2/10)完全开裂,隐约可见绿色子叶,3天后9个种源地莲子的子叶全部伸出果皮剪口。其中,普兰店古莲萌芽速度最快,均萌芽长度2.4 cm,最长胚芽长约4 cm;澳大利亚莲萌芽相对较慢,胚芽仅伸出果皮剪口。以萌芽长度做比较,9个种源地无菌莲胚的萌发速度为普兰店古莲>越南莲>印度莲>黑龙江莲>微山湖红莲>白洋淀红莲>泰国莲>美洲莲>澳大利亚莲。
2.3 初代培养8个种源地莲胚的幼苗生长势比较
初代培养5天时,消毒操作对莲胚基本无伤害,接种的莲胚陆续生根。由于澳大利亚莲生长势较弱,且仅4粒,本研究中之后数据未作分析。其他8个不同来源地试材的幼苗在叶片短径、叶柄长、长根数、总根数及茎节间粗等指标存在显著差异(表3)。其中,叶短径最长的为白洋淀红莲和黑龙江莲(12.0 mm),最短的为美洲莲;普兰店古莲的叶柄最长(56.6 mm),而黑龙江莲的叶柄长度仅为其的1/6;就根数而言,白洋淀红莲此时生根效果最好,越南莲和印度莲的生根则表现较差(表3)。综合比较,初代培养5天时,8个不同来源地的莲离体幼苗中,普兰店古莲胚的整体生长势最好,越南莲生长势最差(表3)。此时的生长差异表现可能与莲的生态型、基因型密切相关。
初代培养10天时,离体培养幼苗的主要生长特征为根数显著增加,根状茎开始伸长并产生新的茎节。8个种源地莲胚幼苗之间的叶柄长、根数(长根数、总根数)、茎节数及茎节间长等5个指标差异明显:印度莲和泰国莲的叶柄长度差异最大,后者是前者的3.4倍;普兰店古莲生根最多,单株均值达14条根,泰国莲次之,越南莲最少,均值小于4条(表3)。在根状茎生长过程中,普兰店古莲展示出了较强的茎节形成能力,单株均值达2节,其余种源地材料仅1节;而在茎节间长方面,白洋淀红莲显著大于越南莲和泰国莲(表3),暗示此时期其根状茎生长速度较快。比较隶属函数均值,初代培养10天时,白洋淀红莲及普兰店古莲的整体生长势最好,而黑龙江莲和美洲莲生长偏弱(表3)。
表3 培养5、10天时不同种源地莲的成熟胚离体培养幼苗生长比较 |
编号 | 叶数 | | 叶短径/mm | | 叶柄长/mm | | 长小于1 cm根数 | | 长大于1 cm根数 | | 总根数 |
5 d | 10 d | | 5 d | 10 d | | 5 d | 10 d | | 5 d | 10 d | | 5 d | 10 d | | 5 d | 10 d |
PLD | 1.8±0.53a | 2.0±0.00a | | 10.2±1.74ab | 7.5±2.60a | | 56.6±18.51a | 39.6±12.91ab | | 2.8±1.32a | 5.0±1.23a | | 0.8±0.58bc | 9.4±1.97a | | 3.6±1.57ab | 14.4±2.32a |
HLJ | 2.2±0.17a | 3.0±0.00a | | 12.0±0.45a | 9.6±1.04a | | 14.5±1.92b | 30.7±4.44ab | | 1.8±1.05a | 5.0±0.86a | | 0.2±0.17c | 5.7±0.56ab | | 2.0±1.83ab | 10.7±1.09ab |
BYD | 1.8±0.25a | 3.0±0.00a | | 12.0±0.41a | 13.1±3.37a | | 32.8±12.18ab | 44.8±14.96ab | | 1.0±0.71a | 5.3±1.44a | | 4.0±1.41a | 5.3±1.11ab | | 5.0±1.68a | 10.5±0.87ab |
WSH | 1.8±0.20a | 2.4±0.40a | | 8.6±1.29ab | 9.1±0.97a | | 21.0±9.80b | 31.7±8.10ab | | 2.6±0.87a | 5.4±0.51a | | 0.2±0.20c | 4.0±1.41ab | | 2.8±0.86ab | 9.4±1.12ab |
VN | 1.0±0.32a | 3.0±0.26a | | 9.0±1.08ab | 9.1±0.99a | | 33.5±10.49ab | 44.1±6.94ab | | 0.5±0.50a | 2.8±1.40a | | 0.0±0.00c | 2.8±0.79b | | 0.5±0.50b | 4.6±2.32b |
TH | 1.3±0.75a | 2.8±0.48a | | 11.0±1.58ab | 5.8±3.38a | | 44.8±7.04ab | 20.9±12.49b | | 1.0±0.58a | 5.5±1.93a | | 2.5±1.50ab | 6.5±2.22ab | | 3.5±2.06ab | 12.0±4.14ab |
IN | 2.0±0.26a | 2.2±0.49a | | 10.5±1.47ab | 9.5±3.50a | | 48.2±8.87ab | 70.3±53.25a | | 0.3±0.33a | 3.3±1.65a | | 0.0±0.00c | 5.3±3.09ab | | 0.3±0.33b | 8.5±4.74ab |
NLU | 1.3±0.48a | 2.4±0.40a | | 7.0±0.41b | 6.7±2.38a | | 26.8±7.95ab | 28.3±13.30ab | | 0.5±0.50a | 2.5±1.66a | | 0.8±0.75bc | 4.0±2.16ab | | 1.3±1.25ab | 6.5±3.66ab |
编号 | 茎节数 | | 茎节间长/mm | | 茎节间粗/mm | | 隶属函数均值 | | 综合排名 | | |
5 d | 10 d | | 5 d | 10 d | | 5 d | 10 d | | 5 d | 10 d | | 5 d | 10 d | | | |
PLD | 1.0±0.00a | 2.0±0.00a | | 13.2±0.86a | 6.2±0.53ab | | 2.2±0.20d | 2.8±0.39a | | 0.62 | 0.75 | | 1 | 2 | | | |
HLJ | 1.0±0.01a | 1.0±0.00c | | 9.0±1.21a | 5.9±0.64ab | | 3.1±0.07ab | 2.9±0.20a | | 0.43 | 0.11 | | 4 | 8 | | | |
BYD | 1.0±0.02a | 1.0±0.00c | | 12.0±0.00a | 6.9±0.77a | | 3.0±0.00abc | 3.0±0.20a | | 0.6 | 0.75 | | 2 | 1 | | | |
WSH | 1.0±0.03a | 1.0±0.00c | | 9.8±1.50a | 6.4±0.46ab | | 2.4±0.40bcd | 3.1±0.11a | | 0.27 | 0.6 | | 6 | 4 | | | |
VN | 1.0±0.04a | 1.2±0.17bc | | 9.3±1.93a | 4.6±0.38b | | 2.5±0.29bcd | 2.8±0.25a | | 0.16 | 0.55 | | 8 | 5 | | | |
TH | 1.0±0.05a | 1.0±0.00c | | 9.3±1.11a | 4.6±0.41b | | 3.4±0.20a | 3.1±0.15a | | 0.55 | 0.61 | | 3 | 3 | | | |
IN | 1.0±0.06a | 1.0±0.00c | | 10.2±1.01a | 5.2±0.81ab | | 2.7±0.21bcd | 2.1±0.78a | | 0.33 | 0.54 | | 5 | 6 | | | |
NLU | 1.0±0.07a | 1.4±0.26ab | | 9.0±1.58a | 5.6±0.58ab | | 2.3±0.25cd | 2.9±0.30a | | 0.22 | 0.51 | | 7 | 7 | | | |
| 注:同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。PLD代表普兰店古莲,HLJ代表黑龙江莲,BYD代表白洋淀红莲,WSH代表微山湖红莲,VN代表越南莲,TH代表泰国莲,IN代表印度莲,NLU代表美洲莲。下同。 |
初代培养20天时,8个种源地莲胚的离体培养幼苗生长势处于快速生长期,在叶、根、茎指标上的差异大且显著。就叶片而言,泰国莲的最大叶短径为美洲莲的2.1倍,印度莲的叶柄比美洲莲要长111.1 mm(表4),即离体培养条件下美洲莲幼苗表现为叶片较小和叶柄较短。同时发现,各种源地幼苗的总根数已无差异,但短根(≤ 1 cm)数量普遍大于长根(>1 cm)数量(表4),可见本时期的新生根较多,暗示植株对营养物质的需求增加。此阶段,白洋淀红莲长势最好,其次为黑龙江莲和越南莲,美洲莲最差;整体比较而言,此阶段生长势相对较好的是中国野生莲。初代培养30天时,培养基内营养物质已被大量消耗,植株的生长速度明显减缓。此时泰国莲的整体生长势仍然较好,而美洲莲较弱。除叶柄粗和茎节间长外,其他指标均存在显著差异(表5)。叶数指标中,白洋淀红莲正常叶片数为1.5片,主要因为早期的叶片出现了枯萎现象,暗示此类型离体培养条件下需尽早继代培养。与上一时期相比,8个种源地中6个种源地的莲胚幼苗总根数有不同程度减少,且长根(>1 cm)数量普遍多于短根(≤1 cm)数量,间接说明幼苗生长速度降低。同时,8个种源地幼苗茎节数也发生分化,其中越南莲和泰国莲形成了较多茎节,节数分别达5.2、5.0个,而节间长度较长的白洋淀红莲仅1.5个茎节(表5)。综上所述,在初代培养20~30天越南莲和泰国莲生长速度较快,故在30天时,两者均表现出了极好的生长态势,而美洲莲和微山湖红莲生长指标偏低(表5)。
2.4 继代培养中8个种源地莲胚幼苗的离体培养长势与增殖差异
以初代培养30天的无菌苗为材料,以2个茎节作为一个单体进行剪切,转接到继代培养基中培养,30天时调查各指标。所得隶属函数均值显示,8个种源地莲之间,越南莲总体生长势最好,其次为泰国莲,普兰店古莲增殖效果相对不佳(表6)。所有指标中,除叶数、总根数和茎节数外,其他指标在各种源地莲之间均存在显著差异。在叶相关指标中,叶柄长度差异幅度最为明显,美洲莲叶柄最长,约为最短的泰国莲2倍。相反,后者展开叶片数最多,而前者最少,但其叶长径最长,为其叶短径的1.35倍(表6),即组培条件下美洲莲叶片不同于其自然状态下的近圆形。单株幼苗形成芽数是评价莲幼苗增殖能力强弱的重要指标之一。在此继代中形成芽数最多的为越南莲,达10.6个,泰国莲以5.6个次之,美洲莲最少,仅1.3个,可见在芽增殖能力上越南莲远优于其他7个种源地莲(表6)。在根状茎生长方面,美洲莲呈现了茎节间延伸能力强的特征,其节间均长可达34.6 mm,但同时其茎节间最细;此外,亚洲莲中的越南莲和泰国莲幼苗也表现出根状茎节间偏细的特点,可能同其为热带、亚热带型资源相关。该类型莲的根状茎不膨大或少见轻微膨大,明显不同于根状茎显著膨大的藕莲和一般膨大的花莲。这些数据表明,在继代培养中,不同种源地莲的幼苗表现差异明显,相对而言,泰国莲与越南莲的长势更好、增殖力更强。
表4 培养20天时不同种源地莲的成熟胚离体培养幼苗叶、根和茎的生长指标比较 |
编号 | 叶数 | 叶短径/mm | 叶柄长/mm | 叶柄粗/mm | 长不大于 0.5 cm根数 | 长0.5~1 cm根数 | 长大于1 cm根数 |
PLD | 2.3±0.85a | 12.5±0.50ab | 58.2±3.38a | 1.7±0.15a | 5.7±1.76ab | 7.3±2.03a | 4.7±4.00abc |
HLJ | 3.5±0.22a | 13.8±0.94ab | 123.0±9.39a | 1.4±0.08a | 3.5±0.56b | 1.8±0.60b | 6.5±1.43abc |
BYD | 3.8±0.25a | 12.5±1.55ab | 54.1±10.56a | 1.4±0.07a | 5.3±0.63ab | 2.3±1.03b | 5.5±0.50abc |
WSH | 2.4±0.68a | 13.6±1.57ab | 58.3±8.26a | 1.4±0.28a | 9.3±3.38a | 1.3±0.95b | 2.8±0.94bc |
VN | 3.1±0.33a | 15.2±2.61ab | 99.8±4.19a | 1.5±0.08a | 3.3±1.20b | 2.2±0.65b | 6.0±2.27abc |
TH | 2.8±1.25a | 17.7±0.33a | 80.4±5.23a | 1.5±0.13a | 4.0±1.00ab | 0.0±0.00b | 11.0±3.00a |
IN | 2.4±0.51a | 12.5±2.93ab | 136.8±8.07a | 1.2±0.16a | 1.3±0.33a | 3.3±1.86b | 9.3±2.73ab |
NLU | 2.7±0.33a | 8.5±1.00b | 25.7±5.65a | 1.2±0.22a | 7.0±2.00ab | 0.0±0.00b | 2.0±0.00c |
编号 | 总根数 | 茎节数 | 茎节间长/mm | 茎节间粗/mm | 隶属函数均值 | 综合排名 | |
PLD | 17.7±1.45a | 2.0±0.00ab | 4.3±0.88ab | 2.9±0.07ab | 0.52 | 4 | |
HLJ | 11.8±1.28a | 2.0±0.00ab | 7.2±0.67a | 3.1±0.17ab | 0.55 | 2 | |
BYD | 13.0±0.71a | 2.0±0.00ab | 6.6±0.59ab | 3.6±0.10a | 0.56 | 1 | |
WSH | 13.3±4.59a | 2.0±0.00ab | 4.1±0.72b | 2.7±0.17b | 0.38 | 6 | |
VN | 11.5±3.06a | 2.5±0.22a | 6.7±0.73ab | 2.9±0.22ab | 0.55 | 3 | |
TH | 11.5±0.50a | 2.0±1.00ab | 5.8±1.17ab | 2.8±0.15b | 0.52 | 5 | |
IN | 14.0±4.04a | 1.0±0.45b | 6.7±1.17ab | 2.9±0.32ab | 0.35 | 7 | |
NLU | 9.0±2.00a | 1.5±0.50ab | 5.8±1.01ab | 3.1±0.22ab | 0.21 | 8 | |
表5 培养30天时不同种源地莲的成熟胚离体培养幼苗叶、根和茎生长指标比较 |
编号 | 叶数 | 叶长径/mm | 叶短径/mm | 叶柄长/mm | 叶柄粗/mm | 长不大于0.5 cm根数 | 长0.5~1 cm根数 |
PLD | 5.0±1.53ab | 22.6±10.21ab | 18.4±9.05abc | 206.4±16.08ab | 1.2±0.30a | 4.4±1.63a | 2.8±0.17b |
HLJ | 4.3±0.21ab | 29.6±1.36ab | 26.4±1.39ab | 300.4±15.66a | 1.2±0.04a | 2.1±0.58ab | 1.8±0.36bcd |
BYD | 1.5±0.65c | 24.1±9.52ab | 21.6±9.43abc | 128.2±40.33c | 1.4±0.10a | 0.5±0.05b | 7.2±0.41a |
WSH | 2.8±0.86bc | 19.1±4.84ab | 11.3±6.70bc | 101.1±26.81c | 1.1±0.03a | 2.0±1.41ab | 0.79±0.09cd |
VN | 6.0±0.82a | 28.9±1.39ab | 27.5±1.83ab | 196.2±12.75ab | 1.2±0.06a | 3.3±0.67ab | 2.1±0.11bc |
TH | 6.0±0.82a | 33.5±1.06a | 30.3±0.94a | 282.9±19.41a | 1.1±0.04a | 2.8±0.84ab | 2.0±0.02bc |
IN | 4.0±0.41abc | 26.7±1.75ab | 21.9±2.10abc | 201.8±33.84ab | 1.3±0.15a | 1.3±0.75ab | 0.5±0.01cd |
NLU | 3.5±0.50abc | 18.6±2.89ab | 7.8±7.75c | 115.8±48.23c | 1.1±0.28a | 1.5±0.05ab | 0.0±0.00d |
编号 | 长大于1 cm根数 | 总根数 | 茎节数 | 茎节间长/mm | 茎节间粗/mm | 隶属函数均值 | 综合排名 |
PLD | 5.4±2.68ab | 12.6±0.14a | 3.3±0.33b | 5.7±1.20a | 3.2±0.16a | 0.58 | 3 |
HLJ | 6.9±0.82a | 10.5±0.33a | 3.0±0.00bc | 6.1±0.96a | 2.4±0.18ab | 0.56 | 4 |
BYD | 1.0±0.05b | 8.7±0.88ab | 1.5±0.50c | 9.4±3.38a | 2.9±1.14ab | 0.40 | 6 |
WSH | 4.2±0.81ab | 7.0±0.38ab | 2.4±0.25bc | 7.2±1.66a | 1.7±0.18ab | 0.22 | 7 |
VN | 7.6±0.56a | 13.1±0.95a | 5.2±0.87a | 11.1±0.84a | 1.6±0.23b | 0.62 | 2 |
TH | 7.2±1.45a | 12.0±0.28a | 5.0±0.41a | 7.8±1.51a | 1.7±0.17ab | 0.68 | 1 |
IN | 8.8±0.84a | 10.6±0.76a | 2.5±0.29bc | 5.6±0.62a | 2.1±0.16ab | 0.54 | 5 |
NLU | 1.5±0.05b | 3.00±0.10b | 3.0±0.00bc | 5.9±0.68a | 3.0±0.35ab | 0.22 | 8 |
编号 | 叶数 | 叶展开数 | 叶长径/mm | 叶短径/mm | 叶柄长/mm | 叶柄粗/mm | 总根数 |
PLD | 18.7±2.03a | 5.7±1.56b | 31.5±2.22b | 25.8±1.70b | 294.4±23.86cde | 0.8±0.10b | 139.3±15.68a |
HLJ | 10.8±1.11a | 5.5±0.65b | 40.0±3.93ab | 36.1±3.43ab | 326.7±27.78bcd | 1.4±0.08a | 152.3±2.24a |
BYD | 19.5±5.50a | 3.0±1.00b | 44.0±3.21a | 38.7±3.84a | 386.8±43.25ab | 1.1±0.05ab | 92.5±12.5a |
WSH | 21.8±2.29a | 3.0±0.71b | 43.8±3.22a | 37.4±3.59ab | 374.9±39.28abc | 1.4±0.10a | 118.0±4.94a |
VN | 32.1±2.70a | 11.4±0.84a | 38.6±2.24ab | 33.1±2.75ab | 274.4±16.21de | 1.2±0.08a | 218.0±5.24a |
TH | 24.9±9.13a | 12.0±2.11a | 40.8±2.41ab | 38.8±2.43a | 230.0±12.35e | 1.3±0.11a | 176.1±2.84a |
IN | 11.5±0.50a | 4.5±0.50b | 41.5±2.68ab | 36.0±3.15ab | 340.5±30.83bcd | 1.3±0.03a | 99.0±5.00a |
NLU | 11.7±1.67a | 1.3±0.33b | 46.5±2.50a | 34.5±2.50ab | 454.3±25.65a | 1.3±0.05a | 107.0±9.86a |
编号 | 茎节数 | 茎节间长/mm | 茎节间粗/mm | 芽数 | 隶属函数均值 | 综合排名 | |
PLD | 12.0±2.52a | 2.8±0.14c | 2.2±0.19b | 3.7±0.88b | 0.23 | 8 | |
HLJ | 8.8±1.44a | 10.7±2.10b | 3.0±0.19a | 2.0±0.00b | 0.46 | 4 | |
BYD | 7.5±0.50a | 4.1±0.50c | 2.3±0.15b | 3.5±0.50b | 0.40 | 6 | |
WSH | 13.5±1.56a | 11.7±1.77b | 2.4±0.13b | 4.5±1.60ab | 0.53 | 3 | |
VN | 18.4±1.51a | 13.7±1.59b | 1.6±0.13c | 10.6±1.95a | 0.65 | 1 | |
TH | 21.7±9.33a | 9.8±1.16b | 1.4±0.10c | 5.6±1.51ab | 0.58 | 2 | |
IN | 8.0±0.00a | 10.9±1.69b | 2.3±0.35b | 2.0±0.00b | 0.37 | 7 | |
NLU | 7.0±0.57a | 34.6±2.81a | 1.5±0.13c | 1.3±0.33b | 0.42 | 5 | |
2.5 8个种源地莲成熟胚幼苗在初代和继代培养中的生长势变化
试验表明,8个不同种源地的莲成熟胚幼苗均可正常生长与继代增殖,说明改良的消毒方法和初代、继代培养的体系是有效可行的。初代培养时,前期(5、10天)指标中的主要差异体现在叶柄长和根数,随着幼苗生长,叶数、茎节间的特征差异也逐渐表现出来,中国莲(普兰店古莲、白洋淀红莲)生长状况较好,而越南莲和美洲莲的生长较弱;后期(30天)生长差异也明显,主要表现在叶数多、叶柄较长、根和茎节数多等,生长状况较好的是泰国莲和越南莲。比较整个离体培养过程中,各种源地的莲幼苗生长综合排名的变化(图2),越南莲的长势呈现由最弱到最强的持续上升趋势,泰国莲始终排名前4位,这表明了两者比较适应离体培养的条件,因此可作为后续构建遗传转化体系的候选材料。与之相反,普兰店古莲在前期的初代培养中生长情况较好,但继代效果相对不佳,反映其对较长时间离体培养环境不太适应。当然,这种不适应是否通过不断优化培养条件得以改观有待研究。
图2 不同种源地的莲离体幼苗5~30天以及继代培养所测指标的综合排名变化 |
Full size|PPT slide
3 结论
(1)在莲成熟胚的离体培养时,利用适合浓度的植物保护混合剂(PPM)可有效提高莲子的消毒效果,降低外植体污染率。
(2)通过比较试验分析,建立了优化的莲子消毒体系:75%酒精消毒30 s + 2% PPM消毒2 h + 0.05% PPM浸泡催芽3~5天。
(3)国内外8个不同种源地莲的成熟胚离体培养存在差异,主要表现在展开叶数、茎节、根数及侧芽数指标上。
(4)不同地域分布的莲的离体无性系幼苗生长存在一定差异。在本试验中,热带、亚热带分布的越南莲和泰国莲的离体无性系生长势强,是构建莲再生体系和遗传转化体系的良好材料。
4 讨论
4.1 使用植物保护混合剂PPM进行外植体预培养的优势
外植体消毒灭菌困难是制约莲组培快繁体系发展的重要因子之一。孔德政
[16]以莲子为外植体成功获得了莲无性系,但因使用了硫酸和氯化汞消毒,导致莲胚的成活率偏低,且后期生长也受到抑制。以藕芽为外植体,采用氯化汞消毒,在延长处理时间的前提下,降低了接种污染率但也导致存活率下降
[17]。近期,蔡颖欣等
[13]使用先破壳后次氯酸钠消毒的模式处理莲子,实现零污染率,但幼苗长势较弱,推测与消毒后直接剥去的莲胚对离体培养不能快速适应有关。为解决莲子作为外植体消毒效果不佳及直接剥取莲胚离体培养适应性差的问题,本研究设计了添加植物保护混合剂PPM开展莲胚催芽的预培养步骤(
表2),极大地提高了莲胚的消毒效果,且此方法所得莲胚的后期生长势也较理想。
植物保护混合剂含有2种广谱异噻唑酮杀生物剂,是甲基异噻唑酮(Methyl isothiazolone,MI)和氯甲基异噻唑酮(Chloromethyl isothiazolone,CMI)的组合,于1996年引入植物组织培养中,并已被证明对去除外植体组织表面的微生物群有效
[19]。同时,不同于抗生素,PPM具有热稳定性,可与培养基共同进行高压灭菌
[20],并且对植物内部污染也具有极好的抑制和消除作用,如PPM成功根除了矮牵牛(
Petunia hybrida)中的内生菌
[21],可单独使用PPM代替许多抗生素组合。目前,PPM已广泛用于甜瓜(
Cucumis melo)、矮牵牛、烟草(
Nicotiana tabacum)、菊花(
Dendranthem × grandiflora)、欧洲桦树(
Betula pendula)、卡托巴杜鹃(
Rhododendron catawbiense)和北高丛蓝莓(
Vaccinium corymbosum)等多种植物的离体组织培养,其浓度范围为0.5~10 mL/L
[22,23,24,25]。在莲的离体培养中,莲子和藕芽作为外植体时,其果壳内或鳞芽中常含有内生菌是导致培养后期污染加重的主因。鉴于此,本试验在消毒第3步预培养中,针对性地设计了先高浓度短时间、后低浓度长时间PPM处理模式,既最大程度保证了莲子整体消毒效果,又降低了PPM对莲胚幼嫩组织的伤害,最终实现前期外植体的低污染率甚至零污染、后期幼苗生长良好。基于本试验结果及以往报道,PPM用于外植体消毒的优势是在一定浓度下对植物体的损害较小,接种后生长恢复较快。
4.2 利用多个指标及隶属函数法量化莲幼苗生长表现
有关莲离体培养的以往报道主要侧重于外植体污染率和存活率、外源激素对幼苗生长及新芽诱导的影响等方面,对离体幼苗不同培养时期的生长及发育的具体形态特征等未有明确量化分析。本研究设计了叶、根、茎等11个形态特征相关指标,对国内外8个种源地的莲成熟胚在离体培养条件下的生长状况进行量化比较。结果发现,叶数、芽数、不同时期的根数等形态指标在离体幼苗中差异较大,可作为离体培养苗生长势强弱的主要指示特征:在初代培养中,8个种源地离体幼苗中主要差异表现在叶和根数上,前期培养过程中短根数多于长根数,后期则相反,一定程度上20天前植株生长快、后期植株生长减缓。在继代时期主要差异表现在叶柄长度、茎节长度/粗度以及芽数等指标,如美洲莲的茎节间较其他7个种源地更细长、芽数及叶数少,繁殖能力也较弱,这与大田种植中美洲莲的生长势。在离体培养下,由于不同培养时期的莲幼苗长势特征侧重不同,为了整体评估各种源地莲的生长差异引入隶属函数法,对各生长指标进行综合评价。结果显示,此方法获得了较好的量化效果,为后续筛选莲的优良再生及遗传转化体系提供了一个可靠的评估方法。
4.3 不同种源地莲幼苗离体生长势差异
在相同的培养条件下,不同类型莲的胚离体培养在后期的根、茎、叶和芽的分化上存在着一定的差异,其受自身遗传特性控制
[26]。本研究的研究也表明,不同来源地野生型莲的成熟胚离体培养幼苗生长表现差异与其分布、生态型和基因型等相关。在4个不同来源的中国野生型莲中,生活在纬度偏高、气温较低的黑龙江莲茎节相对较短,生长周期也相对短,可能与其生长较寒冷、生长期短的东北生态环境的长期适应性相关。反之,泰国莲和越南莲离体幼苗长势强劲,可能同其在亚热带、热带地区四季生长不停顿
[27]的生态型紧密联系。此外,初代培养时期生长较好普兰店古莲在继代时期生长较弱,其继代周期时间应缩短至20天左右,以保证其高效增殖。在今后莲的离体培养中,除注意外界培养环境及外源激素对其影响外,还应考虑莲的种类、生态型、基因型和自然生长环境、组培苗生长变化周期等因素,以便适当调整培养基配方和继代时间,获得更理想的莲无性系材料。
{{custom_sec.title}}
{{custom_sec.title}}
{{custom_sec.content}}
[1] Hessen D O. Stoichiometry in food webs-lotka revisited [J]. Oikos, 1997, 79: 195-200.
[2] Sterner R W, Elser J J. Ecological stoichiometry: the biology of elements from molecules to the biosphere. Princeton: Princeton University Press, 2002.
[3]Zhang L X, Bai Y F, Han X G. Application of N:P Stoichiometry to Ecology Studies. Acta Botanica Sinica,2003,45(9):1009-1018.
[4]Zeng D H, Chen G S. Ecological stoichiometry: a science to explore the co mplexity of living systems. ActaPhytoecologicaSinica,2005,29(6):1007-1019.
[5] Schindler D W. Balancing planets and molecules. Nature, 2003, 423: 225-226.
[6] Elser J J, Fagan W, Denno R F, et al. Nutritional constraints in terrestrial and freshwater food webs. Nature, 2000, 408: 578-580.
[7] 贺金生, 韩兴国. 生态化学计量学:探索从个体到生态系统的统一化理论[J]. 植物生态学报, 2010, 34(1): 2-6.
[8] Zhang L X, Bai Y F, Han X G. Differential responses of N: P stoichiometry of Leymus chinensis and Carex korshinskyi to N additions in a steppe ecosystem in Nei Mongol[J]. Acta Botanica Sinica, 2004, 46(3): 259-270.
[9] 刘兴诏, 周国逸, 张德强, 等. 南亚热带森林不同演替阶段植物与土壤中N、P的化学计量特征[J]. 植物生态学报, 2010, 34(1): 64-71.
[10] 银晓瑞, 梁存柱, 王立新, 等. 内蒙古典型草原不同恢复演替阶段植物养分化学计量学[J]. 植物生态学报, 2010, 34(1): 39-47.
[11] 高三平, 李俊祥, 徐明策, 等. 天童常绿阔叶林不同演替阶段常见种叶片N、P 化学计量学特征[J]. 生态学报, 2007, 27(3): 947-952.
[12] 张丽霞, 白永飞, 韩兴国. 内蒙古典型草原生态系统中N素添加对羊草和黄囊苔草N:P化学计量学特征的影响[J]. 植物学报, 2004, 46(3): 259-270.
[13] Cleveland C C, Liptzin D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a “Redfield ratio” for the microbial biomass[J]. Biogeochemistry, 2007, 85(3): 235-252.
[14] Tian H Q, Chen G S, Zhang C, et a1. Pattern and variation of C:N:P ratios in China's soils: a synthesis of observational data[J]. Biogeochemistry, 2010, 98(1-3): 139-151.
[15] 陶芾, 滕婉, 李春俭, 等. 我国烤烟生产体系中的养分平衡[J]. 中国烟草科学, 2007, 28(3): 1-5.
[16] 叶科媛. 四川烤烟主产区烟叶蛋白质组研究[D]. 四川农业大学, 2013.
[17] 杨鹏. 攀枝花烤烟质量特点分析及综合评价[D]. 中国农业科学院, 2011.
[18] 张文敏, 姜小三, 吴明, 等. 杭州湾南岸土壤有机碳空间异质性研究[J]. 土壤学报, 2014, 51(5): 1087-1095.
[19] 谭立敏, 彭佩钦, 李科林, 等. 水稻光合同化碳在土壤中的矿化和转化动态[J]. 环境科学, 2014, 35(1): 233-239.
[20] Yuan D G, Zhang G L, Gong Z T, et al. Variations of soil phosphorus accumulation in Nanjing, China as affected by urban development[J]. Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 2007, 170(2): 244-249.
[21] 全国土壤普查办公室. 全国第二次土壤普查暂行技术规程[M]. 北京:农业出版社,1979.
[22] 王绍强, 于贵瑞. 生态系统碳氮磷元素的生态化学计量学特征[J]. 生态学报, 2008, 28(8): 3937-3947.