高效硫化物降解菌的筛选及其除臭效果测定

樊梅娜, 张修, 王丽荣

中国农学通报. 2024, 40(36): 63-68

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中国农学通报 ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (36) : 63-68. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0812
资源·环境·生态·土壤

高效硫化物降解菌的筛选及其除臭效果测定

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Screening of Efficient Sulfide-degrading Bacteria and Determination of Deodorizing Effect

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摘要

本研究旨在筛选高效硫化物降解菌并评估其除臭效果。通过从畜禽粪便、活性污泥、垃圾渗出液、污水中筛选得到的除臭微生物菌群,进行硫酸根诱导率和硫离子降解试验。绘制系统发育进化树,通过鸡粪降解模拟实验进一步验证菌株效果。最终筛选出82株菌株,其中4株菌株硫酸根诱导率较高,按诱导能力排序分别为:3水-5 > 6-3-4 > 5-4-1 > 6-2-1,分别高出对照组75%~108%、58%~83%、50%~67%、20%~41%;3水-5降解硫离子效果最好,2 h时降解率达98.64%。菌株形态特征分析和进化树的构建表明3水-5与Defluvibacter lusatiae type strain DSM11099T在同一系统分支上,同属于污水菌属,鸡粪降解模拟实验表明3水-5对氨气和硫化氢的抑制率可达95%以上。本研究筛选得到的3水-5能够有效提升畜牧养殖场恶臭气体的处理效果,可以为微生物除臭技术的实际应用提供良好的借鉴。

Abstract

The research aimed to obtain efficient sulfur compound-degrading bacteria and measure deodorization effects. Based on deodorizing microbial flora isolated from livestock and poultry manure, activated sludge, leachate, and sewage, sulfate induction rate and sulfur ion degradation tests were conducted, the phylogenetic tree and chicken manure degradation simulation experiments were carried out. A total of 82 bacterial strains were screened, among which 4 strains exhibited higher sulfate induction rates. The order of induction ability was as follows: 3Shui-5 > 6-3-4 > 5-4-1 > 6-2-1, with induction rates being 75%-108%, 58%-83%, 50%-67%, and 20%-41% higher than the control group, respectively. The strain 3Shui-5 showed the best sulfur ion degradation effect, achieving a degradation rate of 98.64% in 2 hours. Morphological characteristics analysis and phylogenetic tree construction indicated that 3Shui-5 belonged to the same clade as Defluvibacter lusatiae type strain DSM11099T, both classified as Aquamicrobium. Chicken manure degradation simulation experiments demonstrated that 3Shui-5 could inhibit ammonia and hydrogen sulfide by over 95%. The strain 3Shui-5 could effectively improve the treatment of malodorous gases in livestock farms, providing a good reference for the practical application of microbial deodorization technology.

关键词

高效硫化物降解菌 / 除臭 / 硫化氢 / 鸡粪降解模拟实验 / 脱硫菌 / 氨气 / 微生物群落 / 硫酸根诱导率 / 硫离子降解 / 畜牧养殖场

Key words

efficient sulfide-degrading bacteria / deodorization / H2S / chicken manure degradation simulation experiment / desulfurization bacterium / NH3 / microbial community / sulfate induction rate / sulfur ion degradation / livestock farms

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樊梅娜 , 张修 , 王丽荣. 高效硫化物降解菌的筛选及其除臭效果测定. 中国农学通报. 2024, 40(36): 63-68 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0812
FAN Meina , ZHANG Xiu , WANG Lirong. Screening of Efficient Sulfide-degrading Bacteria and Determination of Deodorizing Effect. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2024, 40(36): 63-68 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0812

0 引言

工农业生产和人类生活造成了无机硫及有机硫等多种硫化物的大量排放。无机硫成分主要是硫化氢(H2S),有机硫成分相对较复杂,如甲硫醇、甲硫醚、二甲二硫醚、二硫化碳等,这些均是中国重点防控的环境污染物[1-3]。硫化物毒性大并含有恶臭味,能够引起金属和设备腐蚀,严重威胁人类健康[4-6]
目前,硫化物的降解主要采取物理、化学、生物等方法,其中化学与物理处理方法过程复杂,成本较高[7-8]。生物法降解硫化物是近些年发展起来的一项绿色新型技术,能够显著降低工业恶臭气体污染程度[9-11],微生物能够依靠自身代谢活动将恶臭物质加以降解[12-13],具有处理效率高、无二次污染、便于操作、费用低廉等特点,已逐渐成为硫化物降解的新趋势[14-16]。吕溪等[17]从污泥中分离纯化得到一株革兰氏阴性杆状菌株Y1,通过单因素及正交实测定其H2S的脱除效率最高可达98.29%;董晓莹等[18]从污水处理活性污泥筛选到1株革兰阴性细菌CTD843-T-3,发现其脱硫率可保持在92%以上。分离、筛选硫化物降解菌,通过优化组合达到高效安全除臭的效果,对于畜牧养殖场、垃圾站等空气质量改善具有重要意义。
本研究针对臭气中的含硫化合物,从畜禽粪便、活性污泥、垃圾渗出液、污水中筛选高效硫化物降解菌,并测定其除臭效果,以期为畜牧养殖场、垃圾站等场所的恶臭气体处理提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品来源

样品采集自山东泰安污水净化厂、养殖场畜禽粪便、土样等。

1.1.2 培养基

基本无机盐培养基(g/L):KH2PO4 2.0 g,NH4Cl 0.4 g,Na2CO3 0.4 g,MgCl2·6H2O 0.2 g,蒸馏水1.0 L;添加不同浓度(160、320、480、640 mg/L)的硫化钠后配制成选择培养基。
分离纯化培养基:选择培养基加2%的琼脂即成。
活化培养基:营养肉汤培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 富集培养

称取10 g上述样品于含有90 mL无菌水的三角瓶中(含玻璃珠),30℃、150 r/min下振荡30 min,以5%的接种量依次接入到含有160、320、480、640 mg/L硫化钠的无机盐培养基中,30℃、150 r/min进行富集培养。

1.2.2 分离纯化

将富集后的培养液进行梯度稀释后,利用平板涂布法将其涂布于分离纯化培养基中,培养24 h后挑选形态不同的单菌落进行纯化,直至获得单菌落并于斜面中保藏备用。

1.2.3 硫酸根诱导和硫离子降解实验

将分离纯化的菌株活化后,以5%的接种量接入基本无机盐培养基中,底物硫化钠(S2-)初始浓度50 mg/L,30℃、150 r/min摇床培养。取培养液测定S2-含量及SO42-含量,以不接菌处理为对照。
(1)硫酸根诱导率的测定
采用改良硫酸钡比浊法[19]。称取1.4756 g Na2SO4(称量前于105℃干燥2 h),溶于少量纯水后,用1000 mL容量瓶定容,根据梯度稀释测定硫酸根标准曲线。培养后的菌液4000 r/min离心20 min,吸取10 mL上清于25 mL比色管中,加入盐酸2 mL (1 mol/L)、甘油-乙醇(体积比1:2)5 mL,再加入100 mg的氯化钡,轻摇,用2 cm比色皿测其360 nm处的吸光度,以蒸馏水做对照,对照组的测定和上述一致,并根据标准曲线计算硫酸根的浓度。
(2)硫离子降解能力的测定
采用对氨基二甲基苯胺分光光度法[20]。称取7.5 g Na2S·9H2O溶于蒸馏水中,用1000 mL容量瓶定容,避光保存。测量前用蒸馏水稀释成1 mL含10.0 μg硫化物(S2-)的标准溶液,准确移取各浓度下的硫离子标准溶液于50 mL比色管中,加入5 mL的对氨基二甲基苯胺溶液(0.1%)、1 mL的硫酸高铁胺溶液(12.5%),摇匀后放置15 min,测定并制作标准曲线。培养后的菌液4000 r/min离心20 min,吸取8 mL上清液,加入4.8 mL的对氨基二甲基苯胺溶液(0.1%)、0.8 mL的硫酸高铁胺溶液(12.5%),摇匀后放置15 min。以蒸馏水做对照,于670 nm处测量吸光度,根据标准曲线计算硫离子的浓度。

1.2.4 菌株鉴定

(1)形态鉴定
待菌株在营养琼脂(NA)培养基中纯化出单菌落时,观察菌落的形状、颜色、大小、边缘形态、透明度等特征;用结晶紫染色法对菌落染色,使用显微镜观察菌体形态和特征。
(2)分子生物学鉴定
使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的DNA,以此为模板进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,PCR产物送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序,测序结果拼接后利用NCBI进行BLAST序列比对,利用MEGA 6.0软件构建系统进化树。

1.2.5 降硫除臭模拟实验

(1)菌种培养
将过夜活化的菌株接入到基本无机盐培养基中,培养48 h后得到发酵液(活菌数调整至109 CFU/mL),将其作为菌剂处理液。
(2)鸡粪模拟实验
取新鲜的鸡粪15 g置于500 mL无菌矿泉水瓶中,按5%的接种量(菌剂体积与鸡粪的重量比)将菌剂处理液接种于矿泉水瓶中,混合均匀;矿泉水瓶中放置置装有6~7 mL氨气吸收液(2%硼酸溶液)和6~7 mL硫化氢吸收液(锌氨络盐)的离心管,保鲜膜封口;以等量的无菌水处理作为对照。每组3个重复,每隔3 d测量吸收液中的氨气和硫化氢气体含量,并更换吸收液;用硼酸吸收氨气法和酸碱滴定法测定氨气释放量;用亚甲基蓝分光光度法测定硫化氢释放量。
 氨气去除率 = 对照组氨气释放量  菌剂处理组氨气释放量  对照组氨气释放量 ×100%
(1)
 硫化氢去除率 = 对照组硫化氢释放量  菌剂处理组硫化氢释放量  对照组硫化氢释放量 ×100%
(2)

1.2.6 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据分析并作图。

2 结果与分析

2.1 硫酸根诱导率测定

2.1.1 硫酸根标准曲线

硫酸根标准曲线的回归方程为:y =4.3009x-0.0008,R2=0.9979。

2.1.2 菌株的硫酸根诱导率

经过分离筛选后共得到菌株82株,并测定培养24、48、72、96、120、144 h时的硫酸根诱导率。结果表明,3水-5、6-3-4、5-4-1、6-2-1等4株菌对硫酸根诱导率分别高出空白75%~108%、58%~83%、50%~67%、20%~41%,其中,菌株3水-5对硫酸根具有最强的诱导能力,优于其他3株菌株,如图1所示。
图1 不同菌株在不同时间下的硫酸根诱导率

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2.2 硫离子降解率测定

2.2.1 硫离子标准曲线

硫离子标准曲线的回归方程为:y=0.1078x+0.0208,R2=0.9974。

2.2.2 菌株的硫离子降解效率

3水-5对硫离子的降解率在培养1.5 h趋于稳定,2 h时的降解率最高达98.64%;6-3-4对硫离子的降解率在2.5 h时趋于稳定,3 h时最高达88.85%;5-4-1对硫离子的降解率在培养2.5 h趋于稳定,在3.5 h时降解率最高达80.94%;6-2-1对硫离子的降解率在3 h时趋于稳定,在4 h时最高达66.87%,如图2所示。由此可以看出,菌株3水-5对硫离子的降解效果最佳,且在2 h时其降解率达到98.64%。
图2 不同菌株在不同时间下的硫离子降解效率

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2.3 菌株鉴定

菌株3水-5在培养基上呈现乳白色、圆形、不透明的菌落,光滑有光泽,湿润且隆起,如图3a所示;该菌于显微镜下呈球形杆,不产孢,如图3b所示。将测得序列进行Blast比对,发现其与劳契兹水微菌Defluvibacter lusatiae type strain DSM11099T同源性为99.64%。通过进化树的构建,发现二者聚为一支,关系最近,同属于污水菌属,如图4所示。
图3 菌株3水-5的形态特征(a:菌落图;b:菌体图)

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图4 菌株3水-5的进化树构建

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2.4 鸡粪降解模拟实验

结果表明3水-5能够有效抑制鸡粪中氨气和硫化氢的产生,对氨气和硫化氢的抑制率可达95%以上,且能维持9 d,如图5所示。不同处理降解效果依次为:菌液>菌泥>上清液,经菌液处理组降解的鸡粪表现为酸香味,不发霉。
图5 菌株3水-5不同成分的鸡粪除氨降硫效果

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3 讨论

活性污泥、垃圾渗出液、畜禽粪便等作为中国农业污染的主要来源,其产生的臭气物质严重污染环境、危害人类健康[21-23]。微生物除臭法作为生物除臭的关键技术,近年来被广泛应用,其核心在于高效除臭菌株的筛选,曾苏等[24]从垃圾渗滤液中筛选得到一株乳酸片球菌,该菌的去氨率为62.25%,韩保安等[25]从猪粪来源中筛选得到的3株菌株去氨率最高达85.6%。本研究从畜禽粪便、活性污泥、垃圾渗出液、污水中筛选出菌株3水-5,其培养2 h硫离子降解率高达98.64%。具有优异除臭能力微生物的筛选对环境保护、畜禽养殖业健康发展具有重要意义。
硫化物的去除过程伴随着硫元素的代谢,硫氧化细菌能够将硫化物氧化成硫酸盐,从而达到除臭的效果[26]。张玉娜等[27]研究表明,变形菌门是厨余垃圾堆肥除臭过程中的优势菌门,范围在16.9%~83.6%,目前已经发现的硫氧化细菌主要集中在变形菌门气单胞菌属、不动杆菌属、硫磺菌属、硫曲菌属、肠杆菌属等[28]。本研究筛选得到的菌株3水-5,通过菌株形态特征分析、序列比对和进化树构建,发现其与劳契兹水微菌Defluvibacter lusatiae type strain DSM11099T同源性为99.64%,同属于污水菌属,拓展了硫氧化细菌的范围。钟伊雯等[29]研究表明,液态粪污发酵过程伴随着微生物的群落演替,添加有机肥发酵菌剂可以更快腐熟,且样品中污水菌属的相对丰度较对照处理中更高;刘俊新等[30]也报道了一株水微菌及其在脱除含硫恶臭物质中的应用,其对硫化氢的降解效率可达83%以上。
本研究通过鸡粪降解模拟实验,表明3水-5能够有效抑制鸡粪中氨气和硫化氢的产生,且经菌液处理组降解的鸡粪表现为酸香味,不发霉。宋亚琼等[31]研究表明,畜禽粪便臭气物质主要以硫化物、醚类、含苯化合物和酮类为主,而畜禽粪便发酵后散发的香味主要由苯甲醚、壬醛和己醛提供,与本实验结论相符。利用细菌代谢所产生的氨基己酸酯类等次级产物降解臭味气体是微生物除臭技术的主要原理之一[32],本研究表明,3水-5菌液对氨气和硫化氢的抑制率可达95%以上,且能维持9 d,高于菌泥处理和上清处理,推测其代谢产物参与了降解除臭过程,需要进一步研究确定。
单一菌株一般只能够针对性的降解一种或两种恶臭气体,而混合菌群则能够同时去除多种恶臭气体。目前微生物除臭剂多由细菌、乳酸菌、酵母菌等菌株复合而成[33],可同时高效吸收氨气、硫化氢等气体。本研究筛选的3水-5可作为微生物除臭技术的实际应用提供优良菌株。由于臭气污染的产生是一个复杂多变的过程,因此臭气的去除和污染的治理仍需要不断地深入探究。

4 结论

本研究筛选得到一株污水菌属高效硫化物降解菌3水-5,其硫离子降解率最高可达98.64%,通过鸡粪降解模拟实验,其对氨气和硫化氢的抑制率可达95%以上,可有效提升畜牧养殖场恶臭气体的处理效果,能够为恶臭气体处理提供参考。

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畜禽养殖过程中排放的NH<sub>3</sub>、H<sub>2</sub>S和挥发性有机物(VOCs)等恶臭气体对环境、人和动物的健康造成严重的危害。本文概述了畜禽养殖场恶臭气体主要成分及来源、微生物除臭剂的作用机理和研究进展,重点讨论了微生物法降解恶臭气体机理。畜禽养殖场恶臭气体主要来源于动物肠道菌群和畜禽粪尿中土著微生物的厌氧发酵,成分复杂,恶臭气体减排调控成为当前畜禽养殖场的重要任务。生物法除臭因对环境适应能力强、作用时间长、去除效果好而成为当前应用于畜禽养殖场去除恶臭气体的主要手段。微生物除臭剂是将除臭微生物进行组合,利用其生理代谢活动将恶臭气体作为营养物质分解并氧化成CO<sub>2</sub>、H<sub>2</sub>O、S O 4 2 -和N O 3 -等无臭、无害的终产物。

基金

山东省重点研发计划(乡村振兴科技创新提振行动计划)“基于微生物技术的绿色低碳农业产业融合发展关键技术创新及示范”(2022TZXD0041)
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