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黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法建立
Fusarium solani Causing Astragalus membranaceus var. mongholicus Root Rot: Establishment of RT-qPCR Detection Method
本研究成功建立了一种针对黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。该方法基于腐皮镰刀菌翻译延伸因子EF-1α基因序列，设计了特异性引物对FP.F/FP.R，并验证其特异性。建立腐皮镰刀菌的RT-qPCR检测方法；运用所建方法检测黄芪及土壤中腐皮镰刀菌的含量，验证其检测效果。结果表明：设计的引物FP.F/FP.R特异性强，RT-qPCR检测的灵敏度为0.0192 ng/μL，重复性评价显示方法稳定、可靠。应用该RT-qPCR方法，可从黄芪接种发病和疑似发病样本及土壤样本中检测出腐皮镰刀菌。结果表明，3组样本的总阳性检出率均为100%。同时，植株和土壤中腐皮镰刀菌的含量变化与根腐病的严重度基本一致。因此，本研究建立的RT-qPCR方法能够有效地用于黄芪植株及土壤中腐皮镰刀菌的定量检测，为根腐病的早期诊断、预警和病原菌的动态监测提供了重要的技术支持。
The study aimed at establishing a rapid and accurate real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) method for the detection of Fusarium solani, the pathogenic fungus of Astragalus membranaceus var. mongholicus (AMM) root rot. Based on the elongation factor-1α (EF-1α) sequence of F. solani, a pair of specific primers FP.F/FP.R was designed and verified for its specificity. The RT-qPCR detection method was established and then used to detect the DNA content of F. solani in AMM plants and soil samples for verifying its detection effect. The results showed that the designed specific primer FP.F / FP.R was highly specific, and the sensitivity of the established RT-qPCR method was 0.0192 ng/μL. Repeatability evaluation showed that the method was stable and reliable. With the mothed, the pathogen F. solani was detected in F. solani-inoculated and suspected diseased AMM plants as well as soil samples, the positive detection rate being 100% for all samples in the three groups. Meanwhile, the changes of F. solani content in AMM plants and soil samples were consistent with the severity of root rot. The results indicated that the RT-qPCR method could be used in quantitative detection of F. solani in AMM plants and soil to provide technical support for the early diagnosis of and warning against root rot, and the dynamic monitoring of pathogens.
蒙古黄芪 / 根腐病 / 腐皮镰刀菌 / 实时荧光定量PCR / 早期诊断 / 动态监测 {{custom_keyword}} /
Astragalus membranaceus var. mongholicus / root rot / Fusarium solani / real-time fluorescent quantitative PCR / early diagnosis / dynamic monitoring {{custom_keyword}} /
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祖未希, 赵晓霞, 高芬. 芽孢杆菌R57对黄芪的防病提质作用及其鉴定[J]. 中国农学通报, 2022, 38(21):129-135.
研究旨在探讨菌株R57对黄芪的抑菌防病和品质提升作用,并对其进行分类鉴定。采用牛津杯法测定无菌发酵液的体外抑菌效果、浸根法测定离体防病效果、灌根法测定盆栽防病效果;采用灌根法处理黄芪,HPLC-UV-ELSD法测定药效成分含量变化;采用形态学观察、生理生化特性测定和16S rDNA序列分析,确定菌株分类地位。体外抑菌试验结果表明,菌株R57无菌发酵液对根腐病菌F. solani和F. acuminatum的抑菌圈直径分别为(18.02±1.71) mm和(19.96±2.42) mm。离体试验中,R57治疗性处理对2种病菌引起的根腐病在7天和15天时均有显著防效,保护性处理对F. solani和F. acuminatum侵染分别在7天和15天时有明显防效,拮抗处理仅在7天时对F. solani侵染有抑制作用。盆栽试验中,R57发酵液对F. solani和F. acuminatum引起的根腐病,保护性防效分别为61.27%±4.89%和64.33%±8.25%,治疗性防效不显著。R57发酵液施用还可显著促进黄芪中主要活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷的积累。经鉴定,菌株R57为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌株具有“防病提质”的双重功效,可作为微生物制剂的多功能菌株进一步开发研究。
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李文学, 肖瑞刚, 吕苗苗, 等. 葡萄霜霉病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立和应用[J]. 中国农业科学, 2019, 52(9):1529-1540.
【目的】葡萄霜霉病是葡萄生产上重要的单年流行病害,研究旨在构建葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测体系,为葡萄霜霉病的早期诊断和预测预报提供依据。【方法】依据GenBank中葡萄霜霉病菌cox2基因序列设计1对特异性引物（F-cox-Pv/R-Pv）,建立并优化常规PCR和real-time PCR反应体系,利用葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄白粉病菌（Uncinula necator）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、葡萄溃疡病菌（Botryosphaeria dothidea）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae)、辣椒炭疽病菌（C. capsica）、甘草根腐病菌（Fusarium solani）、西葫芦白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）、番茄菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、马铃薯干腐病菌（F. equiseti）、西瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）等14种葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌的菌丝DNA进行常规PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度和可重复性进行评价。运用已构建的real-time PCR体系对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行定量检测,利用SPSS 19.0软件分析接种时间与叶片内葡萄霜霉病菌潜伏侵染量的关系。【结果】研究设计的引物特异性高,常规PCR仅对葡萄霜霉病菌DNA有扩增条带,为139 bp;real-time PCR检测结果表明该对引物对葡萄霜霉病菌有唯一的产物吸收峰,对其他供试菌株均未检测到产物吸收峰。常规PCR检测的灵敏度为10 pg·μL <sup>-1</sup>,real-time PCR的灵敏度可达到0.1 pg·μL <sup>-1</sup>,是常规PCR检测灵敏度的100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建real-time PCR循环阈值（Ct）与模板浓度的线性关系,标准曲线y=42.27-3.36x,相关系数R <sup>2</sup>=0.997,扩增效率为98.50%,线性范围达7个数量级,在2.4×10 <sup>3</sup>—2.4×10 <sup>9</sup> copies/μL呈现良好的线性关系。对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行real-time PCR检测,结果表明叶片内病原菌潜伏侵染量随接种时间的变化呈指数关系增长,y=6.34×10 <sup>4</sup>·e <sup>0.084</sup> <sup>x</sup>,相关系数R <sup>2</sup>=0.936。该real-time PCR检测体系在接种6 h后就可以检测到葡萄霜霉病菌DNA,检测量为5.68×10 <sup>4</sup> copies/μL病原菌DNA。 【结论】构建的葡萄霜霉病菌real-time PCR检测体系的灵敏度远高于常规PCR,且特异性强、重复性好,其Ct值与模板浓度呈较好的线性关系,扩增效率高,可用于定量检测葡萄霜霉病菌的潜伏侵染量。
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