福建地区草莓斑驳病毒全基因组测序和分子变异分析

陈道; 王新; 江山; 张洁; 吴祖建; 丁新伦

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2021-0359

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中国农学通报 ›› 2022, Vol. 38 ›› Issue (6) : 94-101. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2021-0359

生物科学

福建地区草莓斑驳病毒全基因组测序和分子变异分析

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Strawberry Mottle Virus Isolated in Fujian: Complete Genome Sequence and Molecular Variation

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摘要

为了深入解析草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)的分子变异以及遗传多样性,采用小RNA高通量测序结合RACE和RT-PCR技术获得了福建地区SMoV基因组全长序列。SMoV基因组RNA1和RNA2分别为7034 nt和6354 nt,均含有1个ORF,分别编码多聚蛋白P1和P2;SMoV福建分离物同其他15个SMoV分离物的同源性分析表明,RNA1核苷酸和多聚蛋白P1氨基酸同源性分别为79.2%~96.8%和89.0%~99.5%;RNA2核苷酸和多聚蛋白P2氨基酸同源性分别为77.9%~97.8%和89.9%~98.9%。SMoV福建分离物各编码蛋白同其他15个SMoV分离物的同源性分析表明,仅病毒基因组连接蛋白最为保守,其他各蛋白核苷酸序列和氨基酸序列变异均较大。福建分离物和中国部分分离物聚在一个大分支上,和中国分离物DGHY3亲缘关系最近。SMoV中国福建分离物的基因组结构与其他分离物相一致,其核苷酸序列和氨基酸序列分子变异较大,并且和中国其他分离物具有较丰富的遗传多样性,在进化上有一定的地理相关性。

Abstract

To analyze the molecular variation and genetic diversity of strawberry mottle virus (SMoV), high-throughput sequencing (HTS), RT-PCR combined with 3ʹ and 5ʹ RACE were used to obtain the complete genome sequence of SMoV Fujian isolate. The results showed that RNA1 and RNA2 of SMoV consisted of 7034 nt and 6354 nt, and both contained one large ORF, encoding polyprotein P1 and P2, respectively. The homology of SMoV Fujian isolate and other fifteen SMoV isolates was analyzed. The nucleotide and amino acid homology of RNA1 was 79.2%-96.8% and 89.0%-99.5%, respectively. The nucleotide and amino acid homology of RNA2 was 77.9%-97.8% and 89.9%-98.9%, respectively. Among the encoding proteins of SMoV Fujian isolate, only the viral genome-linked protein was the most conserved, the nucleotide and amino acid sequences of other proteins were variable compared to other 15 SMoV isolates. The Fujian isolate and some other Chinese isolates are in a big branch, and most closely related to Chinese isolate DGHY3. The genomic structure of Fujian isolate is consistent with other SMoV isolates. Nucleotide sequence and amino acid sequence of Fujian isolate have obvious molecular variation. Fujian isolate and the other Chinese isolates have abundant diversity, and there is geographical relativity in evolution.

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陈道 , 王新 , 江山 , 张洁 , 吴祖建 , 丁新伦. 福建地区草莓斑驳病毒全基因组测序和分子变异分析. 中国农学通报. 2022, 38(6): 94-101 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2021-0359

CHEN Dao , WANG Xin , JIANG Shan , ZHANG Jie , WU Zujian , DING Xinlun. Strawberry Mottle Virus Isolated in Fujian: Complete Genome Sequence and Molecular Variation. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2022, 38(6): 94-101 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2021-0359

0 引言

草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)为伴生豇豆病毒科(Secoviridae)病毒,其基因组结构还不完全清楚,尚未归属^[1]。SMoV在世界各地分布广泛,是影响草莓生产的重要病毒。SMoV可通过蚜虫以半持久性方式传播,如草莓蚜(Chaetosiphon sp.)、棉蚜(Aphis gossypii)和桃蚜(Myzus persicae)^[2,3],也可通过嫁接和人工摩擦传播。SMoV在指示植物森林草莓(Fragaria vesca)和弗吉尼亚草莓(F. virginiana)株系上表现症状程度不一,从无明显可见症状至表现斑驳、畸形、严重矮化及致死,单一SMoV侵染商品化草莓常常不表现明显症状,但严重的株系可能会降低草莓的生长活力,产量损失可达30%^[4]。SMoV和其他草莓病毒的田间复合侵染非常普遍,通常会引起植株衰退,最终影响草莓产量和果实品质下降,可致产量损失80%^[5,6]。王国平等^[7]、韦石泉等^[3]于20世纪八九十年代对中国草莓主栽区病毒种类的鉴定表明,大部分栽培地的草莓受SMoV感染。近年来,SMoV在中国的江西、福建、北京、新疆和河南等地均有报道^{[8,9,10,11,12,13]}。SMoV基因组含有2条正单链RNAs（RNA1和RNA2）,Thompson等^[14]首次发表了SMoV的基因组全长序列,自2015年以来NCBI数据库收录了来自加拿大和中国等共12个SMoV分离物的基因组全长^[14,15],以及来自捷克的3个SMoV分离物的编码区序列。日本也报道了两个分离物T1和T2的全基因组序列^[16],此外,NCBI也收录了多个SMoV分离物基因组的部分序列信息。SMoV分离物的基因组结构均一致,RNA1和RNA2均含有一个大的开放阅读框(ORF),分别编码一个大的多聚蛋白。近年来在SMoV基因组结构解析方面也取得一定的进展,RNA1全长为7008~7043 nt,Mann等^[17]研究表明RNA1多聚蛋白P1有5个顺式裂解位点,切割为多肽X1、X2、核苷三磷酸结合蛋白(NTB)、病毒基因组连接蛋白(VPg)、类似3C胱氨酸蛋白酶(3CL-Pro)和依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)等6个蛋白,其中3CL-Pro切割RNA1和RNA2编码的多聚蛋白P1和P2^[17]。RNA2全长为5619 ~ 6340 nt,RNA2多聚蛋白P2包含运动蛋白、外壳蛋白以及其他未知功能蛋白;Mann等^[18]的研究表明RNA2编码的一个新型谷氨酸蛋白酶也参与切割多聚蛋白P1和P2。SMoV的基因组结构还有待进一步明确。与首次报道的荷兰分离物相比,后续报道的SMoV其他分离物均有更长的RNA2序列,在多聚蛋白P2的C端有额外的239aa,荷兰分离物1134可能为缺陷型突变体^[15]。在SMoV的分子变异和遗传多样性研究上,初步研究结果表明,SMoV变异复杂,SMoV分离物具有遗传多样性^{[15-16,19-21]}。近年来随着越来越多的SMoV分离物的出现、更全面的基因组信息的解析,为进一步研究SMoV的分子变异和遗传多样性提供了基础。笔者在福建省草莓病毒病调查过程中发现疑似表现病毒病的病株,对表现疑似病毒病症状的草莓样品进行小RNA高通量测序(high-throughput sequencing,HTS),检测到SMoV,SMoV福建分离物基因组序列尚未见报道,而且中国SMoV分离物基因组特征、各基因的分子变异等未见报道。因此在HTS基础上进一步获得了SMoV福建分离物的基因组全长,结合NCBI中已公布的全基因组序列,分析SMoV中国福建分离物的分子变异和遗传进化特征。获得SMoV基因组全序列并对其进行分析,对研究病毒的遗传变异研究具有重要意义,也为明确SMoV的基因组结构、蛋白功能、致病机理以及抗病品种筛选等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品

草莓样品采自福州市闽侯县商品化草莓种植地,样品保存于-70℃。

1.2 小RNA提取、文库构建和高通量测序

取0.1 g草莓叶片,按照mirPremier microRNA Isolation Kit试剂盒(Sigma-Aldrich)的操作步骤提取小RNA;small RNA文库的构建按照NEBNext Multiplex Small RNA library Prep Set for Illumina试剂盒(New England Biolabs)的操作方法进行。高通量测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。采用Illumina HiSeq平台测序,测序长度1×50 bp,采用HiSeq控制软件(HCS)+OLB+GAPipeline-1.6 (Illumina)进行图像分析和碱基测定。使用Cutadapt (version 1.9.1)^[22]对测序原始数据去除接头以及低质量序列等,得到后续信息分析用的Clean Data。用短序列比对工具bowtie (v0.12.9)^[23]标记比对到草莓的参考基因组序列,保留没有比对到宿主上的序列,以排除草莓基因组的RNA序列;使用velvet (v 1.2.10)^[24]对病毒的序列进行组装,并用Blast(NCBI)进行注释;为进一步验证注释到的病毒的准确性,选取所有注释到的病毒作为候选病毒,下载所有候选病毒的参考基因组,利用短序列比对软件bowtie 2将clean reads比对到候选病毒的参考基因组上,统计每个样本在每个候选病毒基因组上的覆盖度及覆盖深度,从而鉴定样本中所含病毒物种信息。高通量测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。高通量测序于2018年在苏州金唯智生物科技有限公司完成。

1.3 总RNA提取、RACE和RT-PCR扩增

取0.1 g草莓叶片,按照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂（天根生化科技有限公司）的说明提取草莓总RNA,用RT reagents反转录试剂盒(Takara)将提取的总RNA合成cDNA;以HTS获得的SMoV Contig序列设计引物（表1）,利用PCR分段扩增SMoV的基因组序列,PCR循环参数为95℃ 10 s,95℃ 10 s,退火10 s,36个循环,退火温度见表1。采用SMARTer RACE 5ʹ/3ʹ试剂盒(Clontech)获得SMoV RNA1和RNA2的5ʹ和3ʹ末端序列,操作按说明书进行;获得的PCR产物经回收后,克隆至pEASY-Blunt Simple载体（北京全式金生物技术有限公司）,阳性克隆子经PCR鉴定后送铂尚生物技术有限公司测序。该试验于2018—2020年在福建农林大学植物病毒研究所进行（表2）。

表1 本研究中使用的引物

引物名称	引物序列	退火温度/℃
RNA1-1	F:AGTTCATCGCTCTCACTGAGGTG;R:GTGAAAGGACACATGCGCGTGCC	57
RNA1-2	F:ACATTGCGACGAACTTCCGAAG;R:ATTCGAGTTCATCGCTCTCAC	52
RNA1-3	F:GGCACGCGCATGTGTCCTTTCAC;R:GAACCTGTGCAAGCCTTTGCCAT	57
RNA1-4	F:CAGGTCTTGGATTTGAATGATTC;R:GACAATGGCAGTTCTACTGGC	52
RNA1-5	F:GCCAGTAGAACTGCCATTGTC;R:ATAAACCGGCCTTATCATAAGC	51
RNA1-6	F:GCTTATGATAAGGCCGGTTTAT;R:GCTGAAGTGGGTCACTACTCCAC	52
race1-3	GATTACGCCAAGCTTACACTGGTCTCGGGATGTTGACCGC	63
race1-5	GATTACGCCAAGCTTTGCCACCCTGTTCAACACATTGTG	57
RNA2-1	F:TGGATTGTCCTTCGTCACTG;R:ACAGGCTAACACCATCGACACTAG	52
RNA2-2	F:CTAGTGTCGATGGTGTTAGCCTGT;R:ATATCAGCATCCTTCTGACCACA	53
RNA2-3	F:TGTGGTCAGAAGGATGCTGATAT;R:ACAGGACCCTTGGAATGGTCAT	53
RNA2-4	F:ATGACCATTCCAAGGGTCCTGT;R:TCGGTTCACGTCCTAGTCTCAC	55
race2-3	GATTACGCCAAGCTTTGGCAGTCTTCCATCCTGGTGCCCT	63
race2-5	GATTACGCCAAGCTTGTGTCAAAGGAATGGGTGATATTGAG	58

表2 本研究所用SMoV分离物名称、来源和登录号

分离物名称	样品来源	登录号
FuJian	中国福建China	MW383501 / MW383502
DGHY3	中国China	MT070747 / MT070752
DGHY21	中国China	MT070748 / MT070753
BJMX7	中国China	MT070751 / MT070756
SDHY1	中国China	MT070749 / MT070754
SDHY5	中国China	MT070750 / MT070755
NSper17	加拿大Canada	KU200458 / KU200459
NSper3	加拿大Canada	KU200456 / KU200457
NSper51	加拿大Canada	KU200460 / KU200461
NB926	加拿大Canada	KU200453 / KU200454
Ontario	加拿大Canada	KU177218 / KU177219
Simcoe	加拿大Canada	MH746440 / MH746441
1134	荷兰Netherlands,NL	AJ311875 / AJ311876
SMoV_RNA1_A	捷克The Czech Republic,CZ	MH013322 / MH013325
SMoV_RNA1_B	捷克The Czech Republic	MH013323 / MH013326
SMoV_RNA1_C	捷克The Czech Republic	MH013324 / MH013327
DGHY17	中国China	MT085786
DGHY10	中国China	MT085782
DGHY25B	中国China	MT085791
DGHY11A	中国China	MT085783
DGHY20B	中国China	MT085788
DGHY20A	中国China	MT085787
DGHY26	中国China	MT085792
DGHY11B	中国China	MT085784
DGHY24	中国China	MT085789
DGHY25A	中国China	MT085790
DGHY16	中国China	MT085785
DGHY9	中国China	MT085781
IRNS69	伊朗 Iran	KT864988
IRNS20	伊朗Iran	KT864987
CN1	中国China	AY937262
SDHY32B	中国China	MT085795
SDHY31	中国China	MT085793
SDHY33	中国China	MT085796
SDHY32A	中国China	MT085794
1278	荷兰Netherlands	AJ496145
1509/4	波兰Poland,PL	AJ496147
167	波兰Poland	AJ496148
197/3A	捷克The Czech Republic	AJ496149
3CH	智利Chile	AJ496151
ST	德国Germany,GER	AJ496154
HD	德国Germany	AJ496153
9032.001M	美国United States,USA	AJ496152

1.4 SMoV（病毒）全基因组序列分析

采用SeqMan (Lasergene)将SMoV基因组部分序列片段组装为完整的基因组序列;采用在线软件ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)预测病毒的ORF。采用Clustal W方法进行序列比对;利用Mega(v6.0)以邻接法(Neighbor-joining)构建系统进化树,以自展法(Bootstrap)检验构建系统树的可靠性,自展重复次数设定为1000次,以黑莓坏死病毒(black raspberry necrosis virus,BRNV)USA分离物（基因登陆号:NC_008183）作为外类群。

2 结果与分析

2.1 小RNA HTS测序鉴定SMoV

草莓病叶经小RNA提取、文库构建和高通量测序获得38071864条reads,过滤去除比对到寄主草莓基因组的reads后,共获得未比对到草莓基因组的reads为17263723条,对该序列的长度和数量进行分析,小RNA的长度主要分布在18~32 nt,其中长度为21 nt、22 nt和24 nt的小RNA含量较高,为15%~25%,其他小RNA的含量均低于10%。使用去除寄主sRNA后的reads进行组装获得拼接后的序列(contig),样本拼接结果进行病毒参考基因组数据库Blastn注释,共有16个contigs分别注释为SMoV基因组RNA1和RNA2序列,序列相似性为95%~100%（图1）。为进一步验证注释到的病毒的准确性,选取SMoV的基因组RNA1（NCBI登录号:AJ311875）和RNA2（NCBI登录号:AJ311876）为候选病毒,统计样本在SMoV基因组上的覆盖率和覆盖深度,结果表明RNA1覆盖长度为2017 nt,覆盖率为28.67%,测序深度为58.52;RNA2覆盖长度为5062 nt,覆盖率为90.09%,测序深度为51.23。来源于SMoV的sRNA在基因组RNA1和RNA2上的分布如图1所示,sRNA在RNA1上的分布不均匀,主要集中在5ʹ非编码区,sRNA在整个RNA2序列区域均有分布,而且分布比较均匀。

图1 sRNA在SMoV基因组上的分布

A:RNA1;B:RNA2

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2.2 SMoV福建分离物全基因组序列测定

为了确认HTS获得的SMoV部分基因组序列,并补足测序没有覆盖到的病毒基因组序列区域、5ʹ以及3ʹ序列,以NGS测序获得的部分基因组序列设计引物以扩增SMoV的全长序列,RT-PCR扩增得到长度为500~2500 bp的RNA1和RNA2序列片段,各片段经组装后获得了SMoV中国福建(FuJian)的基因组RNA1和RNA2,将SMoV的基因组序列提交至GenBank数据库,RNA1和RNA2的登录号分别为MW383501和MW383502。

RNA1全长7034 nt,5ʹ和3ʹ非编码区长度分别为151和1138 nt,含有1个ORF(nt152~5896),多聚蛋白P1推测加工产生6个蛋白,从N端到C端依次为:推测的多肽X1 (nt152~589)、多肽X2(nt590~1195)、NBP(nt1196~3043)、VPg(nt3044~3118)、3CL-Pro(nt3119~3811)和RdRp(nt3812~5893)。RNA2全长6354 nt,5ʹ和3ʹ非编码区长度分别为101 nt和1177 nt,含有1个ORF(nt102~5177),多聚蛋白P2推测加工产生4个蛋白,从N端到C端依次为:MP(nt102~1457)、CP(nt1458~3404)、Pro2-Glu(nt3405~4433)和未知功能多肽(nt4434~5174)。

福建分离物RNA1 5ʹ末端与中国分离物（DGHY3、DGHY21、BJMX7、SDHY1和SDHY5）相比,RNA1的5ʹ末端有额外的核苷酸序列TTAAAGCGCACT;与中国分离物（DGHY3、DGHY21、BJMX7、SDHY1和SDHY5）和加拿大分离物(NSper51)相比,RNA1的3ʹ末端具有额外的核苷酸序列AAATATGAAGGGCAGCTCAATCGCCC;RNA2和其他已公布的全长分离物一样,在C端编码区均有一个717 nt的序列,编码239个氨基酸,荷兰分离物1134则缺失了该段序列。

2.3 SMoV福建分离物的序列同源性分析

对福建分离物以及来自中国（DGHY3、DGHY21、BJMX7、SDHY1和SDHY5）、加拿大（NSper17、NSper3、NSper51、NB926、Ontario和Simcoe）、荷兰(1134)和捷克（SMoV_RNA1_A、SMoV_RNA1_B和SMoV_RNA1_C）等15个SMoV分离物基因组序列分别进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析（表3）,SMoV福建分离物与其他分离物RNA1核苷酸同源性为79.2%~96.8%,与来自中国的3个分离物（MT070748、MT070751和MT070747）同源性较高(96.7%~96.8%),与荷兰分离物1134、加拿大分离物Nsper51和simcoe、以及捷克分离物SMoV_RNA1_A和SMoV_RNA1_B的同源性较低,为79.2%~80.8%;SMoV不同分离物多聚蛋白氨基酸同源性为89.0%~99.5%,与中国分离物DGHY3、DGHY21、BJMX7和SDHY5以及加拿大分离物NB926、NSper3和NSper51的同源性较高,为99.0%~99.5%,其中与荷兰分离物1134、加拿大分离物Nsper51和simcoe的同源性较低,同源性分别为89.0%~89.8%。

表3 SMoV福建分离物与其他分离物的核苷酸和氨基酸序列同源性

基因组	全长和基因	蛋白大小/aa	核苷酸同源性/%	氨基酸同源性/%
RNA1	全长		79.2 ~ 96.8
	多聚蛋白	1914 ~ 1915		89.0 ~ 99.5
	多肽X1	146	85.8 ~ 99.1	87.7 ~ 99.3
	多肽X2	202	76.9 ~ 98.5	90.6 ~ 100
	NBP	616	76.9 ~ 98.2	91.4 ~ 99.7
	Vpg	26	73.1 ~ 100	100
	3CL-Pro	231 ~ 232	73.2 ~ 98.7	82.3 ~ 100
	RdRp	694	74.7 ~ 96.2	88.0 ~ 99.7
RNA2	全长		77.9 ~ 97.8
	多聚蛋白P2	1691		89.9 ~ 98.9
	MP	452	79.8 ~ 98.7	91.4 ~ 99.1
	CP	649	77.1 ~ 98.6	92.1 ~ 99.5
	Pro2-Glu	343	76.4 ~ 98.4	86.6 ~ 98.5
	多肽	247	76.1 ~ 96.5	85.8 ~ 99.2

RNA2全长序列和其他15个SMoV分离物核苷酸序列同源性为77.9%~97.8%,其中与中国5个分离物的同源性均较高,为97.1%~97.8%;与捷克分离物A同源性最低,为77.9%。多聚蛋白P2氨基酸与其他分离物同源性为89.9%~98.9%,与中国5个分离物和捷克分离物SMoV_RNA1_C同源性均较高,为98.0%~98.9%;与荷兰分离物1134同源性较低,为89.9%。

SMoV福建分离物的10个蛋白与其他分离物的核苷酸序列和氨基酸序列同源性见表3,RNA1多肽X1、X2、NBP、3CL-Pro和RdRp核苷酸序列和氨基酸序列变异均较大,最保守的是Vpg蛋白,氨基酸序列同源性为100%,没有发生变异,而核苷酸序列发生变异,同源性为73.1%~100%。RNA2编码蛋白MP和CP变异较小,相对比较保守,Pro2-Glu和N端功能未知多肽变异较大。此外,RNA2的3ʹ末端100个核苷酸序列(nt6229~6328)高度保守,和其他SMoV分离物的核苷酸序列同源性为100%。

2.4 SMoV基因组序列的系统发育树分析

以SMoV中国福建分离物(Fujian)和其他15个SMoV分离物的多聚蛋白P2氨基酸序列构建了系统进化树,结果（图2A）表明,SMoV分离物形成两个大的独立分支,捷克分离物SMoV_RNA1_A单独形成一个分支,其他SMoV分离物聚为一个分支,福建分离物与中国5个分离物DGHY21、BJMX7、SDHY1、SDHY5和DGHY3形成一个大分支,亲缘关系较近,其中与中国分离物DGHY3形成一个小的分支,亲缘关系最近。此外,中国分离物与捷克分离物SMoV_RNA1_C也有较近的亲缘关系。

图2 基于SMoV多聚蛋白P2的氨基酸序列(A)和部分CP区域的核苷酸序列(B)构建的系统进化树

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以SMoV中国福建分离物(Fujian)和其他44个SMoV分离物的部分外壳蛋白(CP)核苷酸序列构建系统发育树,结果（图2B）表明,中国福建分离物和中国9个分离物（BJMX7、DGHY21、DGHY3、SDHY1 SDHY5、DGHY17、DGHY10、DGHY25B和DGHY11A）聚为一个大的分支,其中福建分离物和DGHY3聚为一个小的分支,亲缘关系最近;福建分离物和中国分离物CN1、荷兰分离物1278、伊朗分离物IRNS20也有较近的亲缘关系。中国福建分离物和中国的其他12个分离物亲缘关系较远。

以上2个系统进化树的结果表明,SMoV不同分离物在进化上有一定的地理相关性,如中国部分分离物和加拿大分离物的聚类与病毒的地理来源相对一致。

3 讨论与结论

本研究采用HTS结合RT-PCR的方法获得了中国福建分离物的基因组全长序列,该基因组结构和来自加拿大、中国和波兰等的分离物相一致,SMoV基因组的两条单链RNA1和RNA2均编码一个大的多聚蛋白,RNA1可能剪切为6个蛋白,包含剪切蛋白酶、RDRP和其他功能未知蛋白,RNA2编码的多聚蛋白包括MP和CP以及其他蛋白;虽然SMoV的基因组结构研究有了一定的进展,但是其基因组结构还需进一步研究,其蛋白功能还需进一步验证。

研究表明,SMoV加拿大分离物和波兰分离物存在分子变异^[15,21]。本研究表明,SMoV不同分离物基因组全长的核苷酸和氨基酸变异较大,中国福建分离物和中国其他分离物的同源性较高,而和荷兰、加拿大和捷克的分离物的同源性较低。RNA1推测加工产生的6个蛋白中,仅VPg最为保守,其他各蛋白包括蛋白酶和RdRp等核苷酸序列和氨基酸序列变异均较大;RNA2加工产生的MP和CP的核苷酸序列变异较大,氨基酸序列变异较小,Pro2-Glu和N端的未知功能多肽核苷酸序列和氨基酸序列变异均较大,这进一步表明了SMoV分离物间分子变异较大。SMoV加拿大分离物和波兰分离物有丰富的遗传多样性^[15,21],日本分离物T1和T2的亲缘关系并不是最近,而同源性关系表明T2分离物和加拿大的分离物则有较近的亲缘关系^[16]。本研究表明,福建分离物和中国11个分离物亲缘关系较近,而与中国其他12个分离物和来自其他国家分离物的亲缘关系较远,这进一步表明了SMoV分离物存在遗传多样性。值得注意的是,福建分离物和中国其他分离物同源性较高,但是福建分离物5ʹ末端具有独特的核苷酸序列TTAAAGCGCACT,3ʹ末端具有独特的核苷酸序列AAATATGAAGGG CAGCTCAATCGCCC,该序列的存在可能对病毒的复制或转录有影响。

杨洪一等^[20]的研究表明中国4个SMoV分离物呈现轻微的地理相关性;加拿大分离物的进化亦具有一定的地理相关性^[15],而捷克3个分离物在进化上亲缘关系较远,不表现地理相关性。本研究显示SMoV福建分离物和大部分中国分离物具有一定的地理相关性。由于部分分离物在中国具体的地理来源不详,因此无法推断中国分离物的进化与国内地理分布的相关性。

系统进化分析表明,福建分离物与中国部分分离物聚成一个大的分支,其中福建分离物与DGHY3聚为一簇,亲缘关系最近,福建分离物与DGHY3带毒种苗有可能来自同一个地方,随着种苗的调运而运输到各地,福建分离物可能由某地远距离调运种苗传入。随着中国草莓种植面积的扩大、种苗调运的频繁,预防由于种苗调运而引起的病毒病害的传播是控制病毒病害流行的一个很重要的因素,因此对种苗进行病毒检测也是病毒病害防控的关键环节。生产上和科研中常用核酸分子杂交和PCR技术等常规分子生物学手段检测SMoV^[25,26]。由于SMoV序列变异较大,因此寻找保守的区域设计合适的探针或PCR检测用引物非常关键,更多SMoV分离物基因组全长的解析使得寻找保守序列区域成为可能。通过对SMoV福建分离物和其他分离物的基因组全长序列的比对发现,SMoV RNA2的3ʹ端部分区域的核苷酸序列同源性为100%,高度保守,因此可用此区域作为分子杂交检测或荧光定量PCR检测的区域,也可作为PCR检测引物设计的区域。这样可以避免由于SMoV的变异而导致样品检测为假阴性的问题,从而提高SMoV的检测率。

测定了SMoV中国福建分离物的基因组全序列,该分离物基因组结构与其他分离物的基因组结构相一致;福建分离物和其他分离物核苷酸序列和氨基酸序列同源性差异较大,福建分离物和其他分离物间存在丰富的遗传多样性;系统进化树显示SMoV在进化上具有一定地理位置的相关性。

参考文献

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【目的】研究新疆草莓病毒病病源种类及田间发生情况,建立主要病毒病原多重RT-PCR检测体系,为无病毒草莓生产提供理论和技术支持。【方法】利用已报道的4种草莓主要病毒病原4对特异性引物,分别对新疆主要草莓种植区采集表现疑似病毒病症状的草莓样品共450份,采用单一反转录PCR(RT-PCR)及多重PCR对采集的样品进行检测,分析新疆草莓病毒病的发生情况。【结果】感染新疆草莓有3种主要病毒,南北疆15个不同栽培区均能检测出这3种病毒,每个采集地的病毒检出率均在26%以上。所有样品中病毒总检出率为64.22%;其中,草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)检出率最高,为51.78%;草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)检出率为23.78%,草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)检出率为9.33%,草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)没有检出。病毒复合侵染率达18.45%,两种病毒病复合侵染检出率为16.67%,三种病毒病复合侵染检出率为1.78%;所有样品中对3种病毒的多重RT-PCR与单一RT-PCR检测结果一致。【结论】新疆草莓受SVBV、SMoV和SMYEV三种病毒危害,单一病毒病感染率以及两种以上病毒复合侵染侵染率都较高,在无病毒种苗的培育和生产中加强病毒检测。

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福建农林大学横向科技项目“草莓病毒病害检测与防控”(KH210077A)

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Received	Revised	Published
2021-04-07	2021-06-13	2022-02-25
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2022-03-16

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