微囊型脂肪粉中粗脂肪的快速测定

殷秋妙, 王勇, 强莉, 王威利, 黄晓梅, 孙丽华

中国农学通报. 2021, 37(8): 116-122

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中国农学通报 ›› 2021, Vol. 37 ›› Issue (8) : 116-122. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0373
食品·营养·检测·安全

微囊型脂肪粉中粗脂肪的快速测定

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Crude Fat in Micro-encapsulated Fat Powders: Rapid Determination

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摘要

为了解决新型油脂产品——微囊型脂肪粉因缺乏粗脂肪检验方法造成的贸易困惑,建立了微囊型脂肪粉中粗脂肪含量的快速测定方法。以包埋率较高的微囊型脂肪粉样品为主要试材,通过对酸水解条件和萃取方法的研究而建立方法;并确定了方法的适用范围;对5个不同包埋率微囊型脂肪粉代表性样品依据GB/T 6379.2—2004《测量方法与结果的准确度》进行实验室间验证比对以考察方法的精密度和准确度。建立的方法为:样品(1~2 g)用4 mol/L盐酸在85℃±5℃下水解1 h,而后用20 mL石油醚连续萃取2次(20 mL×2);萃取液蒸馏除去溶剂后于103℃±2℃烘干15 min,重量法测定。验证数据经过柯克伦(Cochran)检验和格拉布斯(Grubbs)检验,结果无离群值,一致准确。该方法的平均重复性误差和再现性误差(RSD)分别为0.34%~0.58%和0.38%~1.33%,完全符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范》对精密度的要求。本方法适用于不含磷脂的微囊型脂肪粉中粗脂肪的测定。和现行标准GB/T 6433—2006相比,本方法更为准确、快速、经济,已经被相关企业采用。

Abstract

To deal with the trade problems of new type products of fat powders caused by lacking suitable determination method of crude fat, a rapid and reliable determination method of crude fat in the products of micro-encapsulated fat powders was developed by selecting the micro-encapsulated fat powders with higher embedding rates as main testing samples and establishing the hydrolysis method and the extraction method. The testing scopes of this method were also studied. According to the requirements of the national standard GB/T 6379.2—2004 Accuracy of Measurement Methods and Results, the accuracy and precision of this method were then determined by testing the crude fat contents of five micro-encapsulated fat powder samples with different embedding rates in 3 independent labs. In this method, the sample (1-2 g) was hydrolyzed by 4 mol/L hydrochloric acid at 85℃ ± 5℃ for 1 h, and then the solution was extracted twice by petroleum ether (20 mL×2). After removing the petroleum solvent by distilling, the residue was dried at 103℃±2℃ for 15 min, then the residue was determined by Gravimetric method. After examined by Cochran test and Grubbs test, the results were found to be consistent and accurate without outliers. The average repeatability errors and reproducibility errors (RSD) of the method were 0.34%-0.58% and 0.38%-1.33%, respectively, indicating that this method could fully meet the precision requirements of the national standard GB/T 27404—2008 Specification for Laboratory Quality Control. This newly developed method is suitable for determination of crude fat in micro-encapsulated fat powder products without phospholipids, and is more accurate, fast and cost-effective, and more reliable when compared with the current standard GB/T 6433—2006.

关键词

微囊型脂肪粉 / 粗脂肪 / 测定 / 柯克伦检验 / 格拉布斯检验

Key words

micro-encapsulated fat powders / crude fat / determination / Cochran test / Grubbs test

引用本文

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殷秋妙 , 王勇 , 强莉 , 王威利 , 黄晓梅 , 孙丽华. 微囊型脂肪粉中粗脂肪的快速测定. 中国农学通报. 2021, 37(8): 116-122 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0373
Yin Qiumiao , Wang Yong , Qiang Li , Wang Weili , Huang Xiaomei , Sun Lihua. Crude Fat in Micro-encapsulated Fat Powders: Rapid Determination. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2021, 37(8): 116-122 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0373

0 引言

灭多威是一种常见的环境内分泌干扰物,具有很强的触杀毒性作用。由于灭多威在农业生产中使用量大,在环境中半衰期长,因此许多地区的土壤、地下水、湖泊和海洋中都检测到了灭多威的残留。有关灭多威对生物毒性效应及机理的研究成为热点。
微藻在水生态系统中发挥着重要作用,作为初级生产者参与水生态系统的能量流动和物质循环[1]。微藻可通过光合作用释放氧气,并为高营养级生物提供有机物。微藻的初级生产量以及种类数量在维持水生态系统的平衡和稳定中发挥着重要作用[2]。由于微藻对毒物敏感,且在水环境中常见,因此常被用来作为污染物质的毒性测试生物[3-4]。大型溞是水生态系统中重要的初级消费者[5],广泛存在于自然水体中,是一种常见的枝角类浮游动物[6]。大型溞繁殖快,易于培养,对水环境中的多种化学物质的变化非常敏感[7],且易在显微镜下观察辨认,是国际上通用的标准毒性试验生物之一,常应用于污染物对水生生物的毒理学研究[8-9]。斑马鱼是水生态系统中重要的次级消费者。斑马鱼单次产卵量大,发育周期短,易于观察药物对鱼体的影响,是国际上公认的毒性试验模式生物,用来评估污染物质的毒性强弱[10]
有关灭多威对水生生物的毒理学研究方面,目前已有一些关于其对某一种鱼、虾、溞等的急性毒性研究,然而将藻、溞、鱼作为食物链,同时开展灭多威对小球藻、大型溞、斑马鱼急性毒性试验的研究则鲜有报道。因此,本试验选用小球藻、大型溞、斑马鱼作为试验生物,研究灭多威对小球藻、大型溞、斑马鱼的急性毒性的强弱,探究灭多威对食物链上处于不同生态位的水生生物的毒性效应。

1 材料与方法

1.1 实验用药

本试验所用灭多威原药由上海焦点生物技术有限公司提供,质量分数大于97%。试验结果中所示浓度均为药物的有效成分含量。灭多威药物保存于4℃冰箱中。

1.2 实验生物

普通小球藻(Chlorella vulgaris)由中国科学院水生生物研究所提供,采用BG-11培养基培养。大型溞(Daphnia magna)由广东省试验动物检测所提供。斑马鱼(Brachydanio rerio)由上海费曦生物科技有限公司提供,为成年斑马鱼,平均体长(3.12±0.22) cm (n=30),平均体重(0.31±0.03) g (n=30)。实验于2020年5—7月在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心开展。曝气天的自来水作为培养用水,pH (7.5±0.2),温度(26±1)℃,光暗比16 h:8 h。将购买的斑马鱼驯化2周后,选择活动性强的健康鱼进行试验。驯化期间每天8:00和17:00各定时投喂大型溞1次,2次的总投饵量为鱼体重4%。试验前一天停止投喂。

1.3 实验仪器

试验所用仪器设备型号及来源见表1
表1 试验仪器及来源
试验仪器 来源
生物显微镜BM2000 上海光学仪器厂,中国
PGX-150B智能光照培养箱 无锡沃信仪器有限公司,中国
双光束紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司,中国
Master-QUT试验室超纯水机 上海和泰仪器有限公司,中国
PWC 124型分析天平 艾德姆衡器(武汉)有限公司,中国
浮游生物计数框 金坛市康华电子仪器制造厂,中国
移液器 Eppendorf,德国

1.4 试剂的配制

稀释水培养基配制方法分别见表2
表2 稀释水培养基成分及含量
成分 浓度/(mg/L)
氯化钙(CaCl2) 2.94
硫酸镁(MgSO4) 1.23
碳酸氢钠(NaHCO3) 0.65
氯化钾(KCl) 0.0625

1.5 小球藻藻种的培养

普通小球藻的培养基为BG-11(表3),放入恒温培养箱中培养,培养条件设定为:温度(25±1)℃,光照强度4000 lx,光暗比为12 h:12 h。定期镜检,确保藻种纯正,无污染。
表3 BG-11培养基成分及含量
成分 浓度/(g/L)
硝酸钠(NaNO3) 1.5
磷酸氢二钾(K2HPO4) 0.04
七水硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.075
柠檬酸(C6H8O7) 0.036
枸椽酸铁铵(C6H10FeNO8) 0.006
乙二胺四乙酸二钠(EDTANA2) 0.001
碳酸钠(Na2CO3) 0.02
硼酸(H2BO3) 2.86
四水氯化锰(MnCl2·4H2O) 1.86
七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 0.22
钼酸钠(NaMoO4) 0.39
五水硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.08
硝酸钴六水合物(Co(NO3)2·6H2O) 0.05

1.6 普通小球藻藻细胞浓度与吸光值之间的线性关系

取处于指数生长期的普通小球藻藻液,藻密度为4.6×106 cells/mL,稀释为7个浓度梯度,在400倍显微镜下进行计数,并在波长660 nm下测定藻液的吸光度值A660 nm,建立藻细胞密度与吸光度值之间的线性关系方程。

1.7 灭多威对水生食物链生物小球藻、大型溞和斑马鱼的急性毒性

小球藻急性毒性试验在盛有150 mL BG-11培养液的三角烧瓶(250 mL)中进行。以0.575对数间距设置灭多威的染毒浓度梯度,分别为0.10、0.38、1.41、5.31、20.00 mg/L。每个浓度设置3个平行,把处于指数生长期的小球藻接种于三角烧瓶中,光照强度为4000 lx,光暗比为12 h:12 h,初始藻细胞密度为1×105 cells/mL。在试验开始后的24、48、72、96 h分别采集藻液,在400倍显微镜下镜检,并计算小球藻细胞密度。
大型溞急性毒性试验在100 mL的烧杯中进行。以0.120对数间距设置灭多威的染毒浓度梯度,分别为25.00、32.90、43.43、57.24、75.44、99.44 μg/L。每个浓度设置3个平行,每个烧杯中盛有100 mL灭多威溶液,各放10只出生6~24 h幼溞。水温(20±1)℃,光暗比16 h:8 h。试验期间不喂食。以心脏停止跳动作为大型溞死亡的判定标准,在试验过程中显微观察大型溞的死亡情况。
斑马鱼急性毒性试验在盛有30 L灭多威溶液的长方体水族缸(40 cm×30 cm×30 cm)中进行。以0.196对数间距设置灭多威的染毒浓度梯度,分别为:1.00、1.57、2.47、3.87、6.08、9.55、15.00 mg/L。每个浓度设置3个平行,每个缸放养10尾斑马鱼。水温(26±1)℃,溶氧(6.8±0.3) mg/L,光暗比16 h:8 h。急性毒性试验的前8 h连续观察,而后分别在24、48、96 h观察并记录。
急性毒性试验中所用的三角烧瓶和烧杯均需在稀硝酸中泡48 h,并用去离子水冲洗,晾干后再使用;而水族缸应在高锰酸钾溶液浸泡48 h,并用曝气7 d的去氯自来水冲洗干净。

1.8 观测指标和测量方法

普通小球藻在波长660 nm下的吸光度值A660 nm:使用紫外可见分光光度计进行测量。大型溞死亡率:通过计数大型溞死亡个体数来计算其死亡率。小球藻的半效应浓度(EC50):依据96 h内急性毒性试验数据,绘制每一组灭多威处理浓度下藻细胞密度随培养时间的生长曲线。按照式(1)计算生长曲线下的面积。
A=N1-N02×t1+N1+N2-2N02×t2-t1++Nn-1+Nn-2N02×tn-tn-1
(1)
其中,A:生长曲线所包围的面积;N0t0时刻藻类的起始细胞数(cells/mL);N1t1时刻测定的藻类细胞数(cells/mL);Nntn时刻测定的藻类细胞数(cells/mL);t1:试验开始后第一次测定的时间;tn:试验开始后第n次测定的时间。
然后按照式(2)计算每一组灭多威处理浓度下的藻细胞生长抑制百分率(IA)。
IA=Ac-AtAc×100%
(2)
其中,IA:每一浓度下藻细胞生长抑制百分率(%);Ac:对照组生长曲线所包围的面积;At:处理组生长曲线所包围的面积。
最后采用直线回归法分析灭多威对小球藻的EC50及其95%置信限[9]。并根据半效应浓度推算安全浓度[9]
大型溞、斑马鱼的半致死浓度(LC50):采用直线回归法分析灭多威对大型溞、斑马鱼的LC50及其95%置信限[9]。并根据半致死浓度推算安全浓度[9]

1.9 数据处理和分析

本试验所有数据均以平均值±标准差(Mean±SD)的形式表示。以灭多威浓度的l g值作为横坐标,以死亡率对应的概率单位作为纵坐标,构建线性回归模型(Linear Regression Analysis),并计算灭多威对小球藻、大型溞和斑马鱼的半效应浓度(EC50)或半致死浓度(LC50)。使用SPSS 25.0软件(SPSS Inc.)进行统计分析,用t检验法检验回归方程相关系数的显著性。P<0.05认为显著。

2 结果与分析

2.1 灭多威对小球藻的急性毒性

2.1.1 普通小球藻细胞密度与吸光值之间的线性关系

使用紫外可见分光光度计测量普通小球藻藻液在660 nm处的吸光值,如图1所示,通过线性回归分析计算得到的普通小球藻的线性回归方程,吸光值与普通小球藻密度之间显著正相关(P<0.05)。
图1 普通小球藻(Chlorella vulgaris)的藻细胞密度-吸光值标准曲线

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2.1.2 灭多威对小球藻的半效应浓度

在不同的灭多威处理浓度环境中,小球藻细胞密度随培养时间的变化趋势如图2所示。空白对照组的小球藻细胞密度呈快速增长趋势,表现为良好的指数式增长。而染毒组的小球藻生长趋势与空白对照组出现明显差异,染毒组小球藻的生长均受到比较明显的抑制,且抑制作用随培养时间的推进和灭多威处理浓度的增加而逐渐增强。
图2 不同灭多威浓度下小球藻的生长曲线

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灭多威对小球藻的EC50、回归方程、相关系数列于表4。96 h的相关系数为0.975,达到显著水平(P<0.05)。灭多威对小球藻的96 h EC50为6.76 mg/L,安全浓度为0.676 mg/L。
表4 灭多威对小球藻的96 h抑制效应
浓度/(mg/L) 0.05 0.19 0.7 2.65 10 37.2
抑制效应/% 9.60 14.70 19.80 32.40 51.30 78.67
回归方程 y=0.7084x+4.4169
相关系数 0.975*
EC50/(mg/L) 6.76
注:*表示相关显著(P<0.05),下同。

2.2 灭多威对大型溞的半致死浓度

灭多威对大型溞急性毒性的回归方程、相关系数、LC50及其95%置信限列于表5。灭多威对大型溞的毒性试验研究表明,在各个时间下,大型溞的死亡率均随着灭多威染毒浓度的增加而增加。灭多威对大型溞的24、48、96 h LC50分别为57.37、22.23、12.58 μg/L,安全浓度为1.26 μg/L。24、48、96 h回归方程的相关系数分别为0.970、0.974、0.986,均达到显著性水平(P<0.05)。
表5 灭多威对大型溞的急性毒性
浓度/(μg/L) 死亡率/%
24 h 48 h 96 h
空白组 0 0 0
25 10.0 53.3 80.0
32.9 26.7 73.3 90.0
43.43 36.7 90.0 93.3
57.24 63.3 93.3 96.7
75.44 66.6 96.7 100
99.44 70.0 100 100
回归方程 y=3.0312x-0.3309 y=3.5589x+0.2059 y=2.441x+2.4863
相关系数 0.970* 0.974* 0.986*
LC50 57.37 22.23 12.58
95%置信限 50.58~65.46 18.32~26.99 10.47~14.45

2.3 灭多威对斑马鱼的半致死浓度

灭多威对斑马鱼急性毒性的回归方程、相关系数、LC50及其95%置信限列于表6。灭多威对斑马鱼的毒性试验研究表明,在各个时间下,斑马鱼的死亡率均随着灭多威染毒浓度的增加而增加。灭多威对斑马鱼的24、48、96 h LC50分别为8.64、5.00、2.12 mg/L,安全浓度为0.212 mg/L。24、48、96 h回归方程的相关系数均达到显著性水平(P<0.05)。
表6 灭多威对斑马鱼的急性毒性
浓度/(mg/L) 死亡率/%
24 h 48 h 96 h
0 0 0 0
1 0 0 17
1.57 0 10 30
2.47 7 20 67
3.87 20 30 77
6.08 27 53 87
9.55 60 73 100
15 73 100 100
回归方程 y=2.69x+2.4768 y=2.165x+3.3674 y=2.7664x+4.0835
相关系数 0.976* 0.978* 0.964*
LC50 8.64 5.00 2.12
95%置信限 7.23~10.77 4.20~6.03 1.76~2.50

3 讨论

3.1 灭多威对小球藻的急性毒性

急性毒性试验是判断化学物安全性的第一步[10]。有关灭多威对微藻的急性毒性试验研究显示,灭多威对近头状伪蹄形藻(Pseudokirchneriella subcapitata)的96 h EC50为72.96 mg/L[11];对水华鱼腥藻(Anabaena)、水华微囊藻(Microcystis flos-aquae)和铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的96 h EC50分别为3.0586、3.1881和7.3476 mg/L[12];对羊角月牙藻(Selenastrum bibraianum)、四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)和斜生栅藻(Tetradesmus obliquus)的96 h EC50为10.2365、1.6321和12.52 mg/L[12]。根据现有资料统计,灭多威对藻类的96 h EC50变化在3.0586~72.96 mg/L,而本试验结果显示,灭多威对普通小球藻的96 h EC50为6.76 mg/L,在上述灭多威对藻类的96 h EC50变化范围内。灭多威对不同种类微藻的毒性效应有所差异,这可能与藻类的形态结构有关,如细胞壁及胞外胶被的有无和厚薄等[13-14]。根据藻类生长抑制毒性评价的分级标准[15],灭多威对小球藻为中毒化学品。

3.2 灭多威对大型溞的急性毒性

与藻类相比,浮游动物对灭多威毒性反应更为敏感。相关灭多威对浮游动物的急性毒性试验表明,灭多威对水蚤(Daphnia)的48 h LC50为32 μg/L[16],对长刺溞(Daphnia longispina)的48 h LC50为220 μg/L[17]。本研究中灭多威对大型溞的48 h LC50为22.23 μg/L,可以看出灭多威对不同种类的浮游动物的毒性效应有所差异。然而付秀娥等[7]研究显示,灭多威对大型溞的 24 h LC50为9.8 μg/L,与本试验灭多威对大型溞的24 h LC50(57.37 μg/L)相差甚大。Fernández等[18]研究显示,灭多威对大型溞的48 h LC50为28.7 μg/L,与本试验灭多威对大型溞的48 h LC50的结果相似。这表明农药灭多威对同一种类浮游动物的急性毒性也可能存在较大差别。依据本次灭多威对大型溞的急性毒性试验结果,按照毒性评价的分级标准,灭多威对大型溞为极高毒性物质。

3.3 灭多威对斑马鱼的急性毒性

有关灭多威对鱼类的急性毒性研究显示,灭多威对麦穗鱼(Pseudorasbora parva)的24 h LC50、48 h LC50、72 h LC50和96 h LC50分别为1.228、0.782、0.538、0.425 mg/L[19];对大鳍鳞鳃太阳鱼(Lepomis gibbosus)、虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)的96 h LC50分别为0.8、3.4 mg/L[20];对日本青鳉鱼(Oryzias latipes)幼鱼、成鱼的48 h LC50分别为0.20、0.87 mg/L[21]。本研究显示,灭多威对斑马鱼的24 h LC50、48 h LC50和96 h LC50分别为8.64、5.0、2.12 mg/L。由此可见,灭多威对不同种类的水生生物的急性毒性存在很大差异,甚至对同一种类的急性毒性也有所不同,这些差异的产生可能与受试生物的健康状况和种类、试验用水的理化特征等有关。按照急性毒性的分级评价标准[15],灭多威对斑马鱼为高毒性[15]
浮游植物、浮游动物、鱼类是水生态系统中重要组成部分。藻类作为水生态系统的初级生产者,是食物链的基础,通过光合作用把自身的营养物质转化成生态系统所必须的物质,并将营养物质加以储存,维持水生态系统的正常运转。浮游动物是水生态系统的初级消费者,能够维持浮游植物的数量,而鱼类捕食浮游动物,浮游动物作为高营养级水生生物的饵料,鱼类和浮游动物对水生态系统的结构和功能具有调节作用。通过小球藻、大型溞、斑马鱼的急性毒性试验,发现灭多威对小球藻、大型溞、斑马鱼毒性表现分别为中毒性、极高毒性、高毒性,毒性强弱表现为:溞类>鱼类>藻类。灭多威对小球藻、大型溞、斑马鱼的毒性均较高,由于灭多威在水中的溶解度极高,为57.9 g/L(25℃),因此在自然环境下,灭多威可能会导致藻、溞、鱼急性中毒死亡,而对水生态系统健康产生严重危害。

4 结论

灭多威对普通小球藻的96 h EC50为6.76 mg/L,安全浓度为0.676 mg/L。灭多威对大型溞、斑马鱼的 96 h LC50分别为12.58 μg/L、2.12 mg/L,安全浓度分别为1.26 μg/L、0.212 mg/L。灭多威对食物链上不同水生生物的毒性强弱表现为:溞类>鱼类>藻类。
根据农药毒性分级标准,灭多威对普通小球藻、大型溞、斑马鱼表现为中毒性、极高毒性和高毒性农药。由于灭多威在水中的溶解度极高,为57.9 g/L(25℃),因此在自然环境下,灭多威可能会导致藻、溞、鱼急性中毒死亡,而对水生态系统健康产生严重危害。

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Abstract

Spray-drying process has been used for decades to encapsulate food ingredients such as flavors, lipids, and carotenoids. During this drying process, the evaporation of solvent, that is most often water, is rapid and the entrapment of the interest compound occurs quasi-instantaneously. This required property imposes a strict screening of the encapsulating materials to be used in addition to an optimization of the operating conditions. Likewise, if the encapsulated compound is of hydrophobic nature, the stability of the feed emulsion before drying should also be considered. Thus, spray-drying microencapsulation process must rather be considered as an art than a science because of the many factors to optimize and the complexity of the heat and mass transfer phenomena that take place during the microcapsule formation. This paper reports the main process engineering information that are considered useful to the success of a microencapsulation operation by spray-drying. Besides, a summary of the most commonly used wall materials and the main encapsulated food compounds are presented.

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基金

2020年广东省企业科技特派员项目和院企合作项目“微囊型脂肪粉质量安全指标检测技术研究”(GDKTP2020064600)

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