比色法快速测定土壤含水量

杨张青,苏伟波,胡小宁,张玉民

中国农学通报. 2016, 32(3): 175-178

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中国农学通报 ›› 2016, Vol. 32 ›› Issue (3) : 175-178. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb15080054
食品 营养 检测 安全

比色法快速测定土壤含水量

  • 杨张青,苏伟波,胡小宁,张玉民
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Rapid Detection of Soil Moisture Based on Spectrophotometry

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摘要

为了建立一种准确、快速、低成本的土壤含水量的检测方法,适于在田间地头和基层实验室推广应用。笔者采用分光光度法进行土壤含水量检测,操作步骤简单,测试速度快,1 个样品的测试时间可控制在5 min 以内。结果表明:该体系的最大吸收波长为660 nm;显色剂的最佳浓度为3.5 g/L、最佳用量为10 mL;当Cl-浓度≤0.45 mg/L(相当于土壤中Cl-为0.45 mg/kg)时对该体系产生的误差≤1.4%,而土壤中的氯离子含量均值为0.1 mg/kg,因此,满足绝大多数土壤的检测。该法与烘干法相比,检测结果绝对误差可控制在3%以内,基本不受土壤类型和化学成分等因素的影响。该法作为一种快速、便捷检测土壤含水量的方法可行,具有推广价值和普及应用优势。

Abstract

The paper aims to build a rapid test method of soil moisture content, which would be suitable for application in the field and the laboratory. The soil moisture content was detected by spectrophotometry, the detection process was simple and could be controlled in 5 min for one sample. The results showed that the maximum absorption wavelength of the solution was 660 nm, the concentration and volume of chromogenic agent were 3.5 g/L and 10 mL. The error of the testing result would be 1.4% or less when the concentration of Cl- was 0.45 mg/L or less (the equivalent of Cl- was 0.45 mg/kg in the soil). Therefore, the test method of soil moisture content was suitable for most agrotypes, because the average concentration of Cl- was 0.1 mg/kg. The absolute error of the rapid detection result was 3% or less comparing with the oven drying method, and it was hardly affected by agrotype and chemical compositions. It was a rapid and convenient test method which had promotion value and application advantages.

关键词

比色法;土壤 含水量;快速 测定

Key words

spectrophotometry; soil moisture; rapid detection

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杨张青,苏伟波,胡小宁,张玉民. 比色法快速测定土壤含水量. 中国农学通报. 2016, 32(3): 175-178 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb15080054
Rapid Detection of Soil Moisture Based on Spectrophotometry. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2016, 32(3): 175-178 https://doi.org/10.11924/j.issn.1000-6850.casb15080054

0 引言

中国大陆是全球最大的鳗鱼养殖和出口国,养殖产量占世界总产量的70%左右,鳗鲡已成为优势出口水产品之一,为中国渔业经济发展做出了极大的贡献[1,2]。鳗鲡养殖主要集中在南方部分省市,受苗种资源的影响,养殖品种也由单一的日本鳗鲡(Anguilla japonica)向欧洲鳗鲡(Anguilla Anguilla)、美洲鳗鲡(Anguilla rostrate)、花鳗鲡(Anguilla marmorata)和双色鳗鲡(Anguilla bicolor bicolor)等多品种养殖发展,养殖工艺、饲料营养及病害防控等关键技术的突破使不同养殖模式日益成熟,促进了鳗鱼产业的进一步稳定发展。在欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡、花鳗鲡以及双色鳗鲡等引进品种的养殖过程中,均不同程度发生了“脱黏败血症”、“红肝症”等危害严重的疾病,导致较高的死亡率[3]。国内一些学者通过流行病学调查分析、病理学研究、病原的检测、分离和鉴定以及致病性等研究,均证实了上述症状的疾病是由鳗鲡疱疹病毒(Anguillidherpesvirus, AHV)引起的[4,5,6,7,8],并对鳗鲡疱疹病毒的生物学、理化特性及其主要囊膜蛋白的特性和功能等进行了深入研究[9,10,11,12]
鳗鲡“脱黏败血病”主要发生在苗种培育阶段,近年来发病率达到60%以上,总体平均死亡率达到20%左右,严重时最高达60%以上,“红肝症”也主要发生在苗种培育的投喂水蚯蚓期间,在苗种培育期间使用药物驱杀指环虫后易导致疾病的暴发,一般苗种培育期发病率达60%以上,不同养殖场死亡率不同,一般死亡率3%~20%,部分养殖场高达50%以上。发病时,养殖场一般采取降低水温,将发病池塘水温控制22℃以下,降低投饵量,严重时停止投饵,同时使用碘制剂、苯扎溴胺等水体消毒剂和三黄、虎黄等抗病毒中草药浸浴鱼体,以降低发病池塘的总体死亡率和缩短病程周期[3]。抗病毒药物吗啉胍(病毒灵)、三氮唑核苷(病毒唑)、金刚烷胺和金刚乙胺等对部分水产养殖病毒病有一定疗效[13,14,15,16],中药制剂黄芪多糖、板兰根等也用于水产养殖病毒性疾病的预防[17,18,19,20],未见鳗鲡疱疹病毒控制药物及使用方法的研究报道。因此,针对鳗鲡疱疹病毒引起的“脱黏败血病”,开展了药物临床治疗试验,旨在为鳗鲡疱疹病毒病防治技术的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验用鱼 美洲鳗鲡取自福建省三明市尤溪县溪尾乡某养鳗场,选择发病死亡严重的养殖池,从池塘底部中央排污箱处捞取体力较弱、具“脱黏败血病”典型症状的病鳗,平均规格为200尾/kg,经实验室PCR检测鳗鲡疱疹病毒阳性后用于试验;对照用鳗鲡取自该场同批次尚未发病的养殖池,平均规格为200尾/kg,取样实验室PCR检测鳗鲡疱疹病毒阴性后用于试验。试验用鳗鲡从养殖池捞取后,暂养于盛有30 L水的50 L塑料桶,试验用水为养鳗场用地下水源水,试验期间水温保持(22.5±1.0)℃,pH 7.6,连续充气增氧,保持水体溶解氧6 mg/L以上,暂养5 h后,捞取试验鳗鲡随机分组,放养至与暂养相同条件的塑料桶中,试验期间不投饵。
1.1.2 试验药物 试验药物鳗疱康1号、2号和3号是本研发小组在前期试验筛选较为有效的组合药物产品,其主要成分为抗疱疹病毒药物、免疫增强剂和辅助药物组成。将药物原料按比例分别称量并混合均匀,使用时按药物:水质量比为1:5的水溶解。

1.2 试验方法

1.2.1 复方药物对鳗鲡疱疹病毒病的浸浴治疗试验 在前期对药物进行浸浴治疗的基础上,进行了治疗药物组方配伍3组,分别命名为鳗疱康1号、2号和3号,浸浴治疗试验浓度详见表1,同时设置患病无药浸浴的阳性对照组(PC)和未患病无药物浸浴的阴性对照组(NC),每个试验组5尾鳗鲡,试验期间连续充气增氧保持溶解氧6 mg/L以上,水温控制(22.5±1.0)℃,每24 h换水补药1次,每次换水50%,补药50%;阳性和阴性对照组换水方法与实验组一致。试验持续药浴168 h,每天观察记录各组鳗鲡的存活情况和外观病症变化情况。
表1 三组复方药物的浸浴治疗浓度
复方药物 药物浓度/(mg/L)
1 2 3 4 5 6
鳗疱康1号 6.25 12.5 25 50 100 200
鳗疱康2号 6.25 12.5 25 50 100 200
鳗疱康3号 10 20 30 40 50
1.2.2 复方药物加盐对鳗鲡疱疹病毒病的浸浴治疗试验 鳗疱康1号、2号和3号药物在不同盐度下的浸浴治疗试验浓度详见表2,同时设置3‰、6‰食盐浸泡治疗试验组、患病无药阳性对照组(PC)和未患病无药阴性对照组(NC)。试验方法同1.2.1,共浸浴168 h,每天观察记录各组鳗鲡的存活情况和外观病症变化情况。
表2 不同盐度下鳗疱康1号、2号和3号复方药物与食盐联用的浸浴治疗浓度
试验组 药物浓度/(mg/L)
1 2 3
3‰食盐 鳗疱康1号 6.25 12.5 25
鳗疱康2号 15 25 35
鳗疱康3号 8 13 18
6‰食盐 鳗疱康1号 6.25 12.5 25
鳗疱康2号 15 25 35
鳗疱康3号 8 13 18
1.2.3 鳗疱康2号和3号复合加盐对鳗鲡疱疹病毒病的浸浴治疗试验 鳗疱康2号和3号二联复合药物在不同盐度下的浸浴治疗试验浓度详见表3。同时设置患病无药阳性对照组(PC)和未患病无药阴性对照组(NC)。试验方法同1.2.1,共浸浴168 h,每天观察记录各组鳗鲡的存活情况和外观病症变化情况。
表3 不同盐度下鳗疱康2号和3号二联复方药物的浸浴治疗浓度 %
试验组 试验药物
鳗疱康2号/(mg/L) 鳗疱康3号/(mg/L) 食盐/‰
1 10 5 3
2 20 5 3
3 10 10 3
4 20 10 3
5 0 0 3
6 10 5 6
7 20 5 6
8 10 10 6
9 20 10 6
10 0 0 6
PC 0 0 0
NC 0 0 0

1.3 疗效评判

采用治疗有效率和病鳗外观症状痊愈情况进行评判,依据168 h后各试验组死亡数量,统计各试验组的累计死亡率(Cumulative mortality rate, RCM)[21]和治疗有效率(Efficiency Rat, ER)[22],各指标计算见公式(1)和(2)。
累计死亡率(RCM)=N0-NtN0×100%
(1)
治疗有效率(ER)=阳性对照组死亡数-药物试验组死亡数阳性对照组死亡数×100%
(2)
式中,N0为治疗试验初始时鳗鲡数量,Nt为治疗试验结束时鳗鲡数量。

2 结果与分析

2.1 三种复方药物对鳗鲡疱疹病毒病的治疗效果

鳗疱康1号、2号和3号药物不同浓度浸浴治疗鳗鲡疱疹病毒病试验组各时段鳗鲡的成活率及治疗有效率详见表4。由表4可见,鳗疱康3号10、20、30 mg/L试验浓度组鳗鲡在36 h后不再出现死亡,药浴60 h后病鳗外观充血症状明显减轻,至108 h后外观充血症状症状基本消失,168 h后病鳗的存活率和治疗有效率达40%,明显高于其余试验组;其余试验组虽然168 h的累计死亡率均达到100%,但其中鳗疱康1号和2号12.5、25 mg/L试验浓度组病鳗存活时间明显长于PC对照组,且在药浴36~60 h后病鳗外观充血症状明显减轻;而鳗疱康1号和2号的50、100、200 mg/L试验浓度组、鳗疱康3号40、50 mg/L试验浓度组病鳗存活时间明显短于PC对照组。
表4 复方药物浸浴治疗试验组鳗鲡成活率及治疗有效率 %
试验组 浸浴时间/h 累计死亡率 治疗有效率
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168
鳗疱康1号 1 100 60 40 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
2 100 60 60 60 40 40 40 20 20 20 20 20 20 20 0 100 0
3 100 100 80 60 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 100 0
4 100 40 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
5 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
6 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
鳗疱康2号 1 100 60 40 40 40 40 40 20 0 0 0 0 0 0 0 100 0
2 100 60 60 20 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 100 0
3 100 60 40 40 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 0 100 0
4 100 60 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
5 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
6 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
鳗疱康3号 1 100 80 60 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 60 40
2 100 80 60 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 49 40 60 40
3 100 60 60 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 60 40
4 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
5 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
PC 100 80 80 80 40 20 20 20 0 0 0 0 0 0 0 100 -
NC 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 -

2.2 复方药物加盐对鳗鲡疱疹病毒病的治疗效果

在3‰、6‰盐度的条件下,3种复方药物不同浓度浸浴治疗鳗鲡疱疹病毒病试验组各时段鳗鲡的成活率及治疗有效率详见表5
表5 不同盐度下三种复方药物浸浴治疗试验组鳗鲡成活率及治疗有效率 %
试验组 浸浴时间/h 累计死亡率 治疗有效率
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168
3‰食盐 鳗疱康1号 1 60 40 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 0 100 0
2 60 60 60 40 40 40 20 20 20 20 20 20 20 0 0 80 0
3 100 60 60 40 40 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
鳗疱康2号 1 100 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 0 80 0
2 100 80 40 40 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 0 100 0
3 100 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
鳗疱康3号 1 100 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 40 60
2 100 60 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 60 40
3 100 80 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 60 40
3‰食盐 100 60 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 80 20
6‰食盐 鳗疱康1号 1 60 40 20 20 20 20 20 0 0 0
2 60 60 60 40 40 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 80 20
3 100 80 60 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 100 0
鳗疱康2号 1 100 100 100 100 60 60 60 40 40 20 20 20 20 20 20 80 20
2 100 60 40 40 40 40 40 40 40 40 20 20 20 20 20 80 20
3 100 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 80 20
鳗疱康3号 1 100 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 40 60
2 100 60 60 60 60 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 60 40
3 100 40 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 80 20
6‰食盐 100 60 60 60 60 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 80 20
PC 100 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 0 100 -
NC 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 -

2.3 鳗疱康2号和3号复合加盐对鳗鲡疱疹病毒病的治疗效果

在3‰和6‰盐度下,鳗疱康2号和3号二联复合药物的浸浴治疗鳗鲡疱疹病毒病试验组各时段鳗鲡的成活率及治疗有效率详见表6。如表6所示,二联复合药物10 mg/L鳗疱康2号+10 mg/L鳗疱康3号试验组的较好,3‰和6‰盐度无明显差异,用药后168 h后的存活率和治疗有效率均为40%,比3‰、6‰食盐浸泡治疗试验组高出1倍;除3‰盐度的20 mg/L鳗疱康2号+10 mg/L鳗疱康3号试验组和6‰盐度的10 mg/L鳗疱康2号+5 mg/L鳗疱康3号试验组的鳗鲡存活时间明显短于PC对照组外,其余二联复合药物各试验组的存活率和治疗有效率均为20%,与3‰、6‰食盐浸泡治疗试验组无明显差异,但明显高于PC对照组。
表6 不同盐度下二联复方药物浸浴治疗试验组鳗鲡成活率及治疗有效率
试验组 浸浴时间/h 累计死亡率 治疗有效率
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168
1 100 60 60 60 60 40 40 40 40 40 40 40 20 20 20 80 20
2 100 100 60 60 40 40 40 20 20 20 20 20 20 20 20 80 20
3 100 80 80 80 80 80 60 40 40 40 40 40 40 40 40 60 40
4 100 60 60 40 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
5 100 60 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 80 20
6 100 80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0
7 100 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 80 20
8 100 60 60 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 60 40
9 100 80 60 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 80 20
10 100 60 60 60 60 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 80 20
PC 100 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 0 100 -
NC 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 -

3 讨论

3.1 合理的给药方法,是水产养殖病害防治的重要途径

鳗鲡“脱黏败血病”是近年来严重危害我国鳗鲡养殖的一种传染性疾病,其病原为鳗鲡疱疹病毒病,具有极强的传染性和致病力,每年造成了较大的经济损失[23]。而水产抗病毒药物的研发起步晚,在临床上能应用于治疗水产病毒性疾病的几乎没有,盐酸吗啉胍是最早应用于水产动物病毒性疾病的抗病毒药物,但因其疗效难予评判,目前已被国家定为15种停止使用的药品行列,虽然兽用抗病毒药物的研究和应用越来越广泛[24,25],但在防治水产动物病毒性病方面无重大突破[26,27,28],而对一些抗病毒中草药的研究则相对深入,基本上还只是停留在鱼体外细胞的抗病毒水平上,在临床应用到鱼体的治疗水平还不够[29,30,31]
对水产动物疾病的治疗方法,给药主要针对群体,一般采用水体给药和拌药饵口服途径[32]。李健等[33]开展了抗病毒药物“对虾克毒王(AVIS)”(中国水产科学研究院与北京海康达生物技术开发公司联合研制)对由杆状病毒引起的“中国对虾暴发性流行病”治疗效果试验观察,使用了不同浓度AVIS药物浸泡治疗带毒中国对虾仔虾成活率达到45.6%~70.0%,采用“药饵+药浴”试验组13天后平均存活率达到95%以上,而感染对照组在8天后无存活。本试验以药浴方式治疗由鳗鲡疱疹病毒引起的美洲鳗鲡“脱黏败血病”也取得了比较明显的疗效,从试验结果可以看出,鳗疱康3号的疗效最好,其次是鳗疱康2号,3‰~6‰食盐对药物治疗其起到明显的协同增效作用。与鳗疱康2号和3号药物单独使用相比,鳗疱康2号和3号二联复合试验组的存活率和治疗有效率明显下降,初步说明了鳗疱康2号和3号并不存在协同增效效果。虽然鳗疱康1号和2号对鳗鲡“脱黏败血病”的疗效不如鳗疱康3号,但药浴治疗能明显延长病鳗的存活时间,在药浴36~60 h存活病鳗的鳃盖、各鳍条充血症状明显减轻,药浴120 h后存活病鳗的败血症状基本消失,说明了鳗疱康对美洲鳗鲡疱疹病毒症有一定的治疗作用,起到减轻症状和延缓鳗鲡疱疹病毒病的发生程度,并能将部分病症严重的鳗鲡治愈。因此,对这些抗鳗鲡疱疹病毒复方配伍药物的优化,有待于进一步研究提高。

3.2 正确的诊断是病害防治的前提

鳗鲡疱疹病毒病的多数表现为“红头、烂鳃和脱黏败血”等主要症状,常与细菌性红头病、烂鳃病和细菌性败血症等临床症状混淆,由于多种疾病能出现相似症状,但处理方法不同,如果没有正确的诊断,一些养殖者在前期使用抗生素治疗,不仅无效,还常导致病情恶化,死亡率飙升[3]。因此,进一步开展鳗鲡疱疹病毒病快速诊断技术,特别是早期诊断技术的研发,以达到正确诊断的目的,是鳗鲡疱疹病毒病科学防控的基础。
由于本试验用感染鳗鲡疱疹病毒的患病鳗鱼是从养殖池中间排污箱周围捞取的,体质较弱,症状较严重,在高浓度试验组药物对病鳗的刺激,病鳗在12~36 h内死亡率均达到100%。而且病鳗已丧失了食欲,无法采用药饵口服治疗的给药方式,如能在疾病早期进行正确诊断,感染鳗鲡疱疹病毒的鳗鱼尚未丧失食欲时,进行药物的内服治疗,可能会获得更为理想的疗效。

3.3 免疫制剂的研发,是鳗鲡病毒性疾病防控的关键

鳗鲡疱疹病毒具有高度的宿主种别专一性,仅在细胞内复制繁殖,其致病性与养殖环境和水温密切相关[3,8]。要想从根本上预防鳗鲡疱疹病毒病暴发,仅依靠药物的治疗和预防是不够的,应采取综合防控等技术措施,重点突破其现场实用化的早期诊断技术,有效疫苗的研制以及免疫预防技术的研发,建立健康养殖管理技术体系,有效控制传染源、切断传播途径,才是鳗鲡病毒性疾病防控的关键。而适当的药物预防和治疗措施以及有效控制继发性疾病感染才能比较有效地控制鳗鲡疱疹病毒病的暴发,以解决目前困扰鳗鲡养殖产业发展的瓶颈。

4 结论

本研究初步筛选出对由鳗鲡疱疹病毒引起的美洲鳗鲡“脱黏败血病”有明显治疗效果的复方配伍药物鳗疱康3号,确定了该药与食盐联用能有效缓解病鳗败血症状,大幅降低死亡率,提高治愈率,为开辟鳗鲡病毒性感染疾病的治疗药物,复方配伍药物鳗疱康具有进一步研发的意义。

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