适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺DNA样品的快速制备试剂研究

姚梦丽, 白昌明, 王崇明, 辛鲁生

渔业科学进展. 2024, 45(04): 166-174

渔业科学进展 ›› 2024, Vol. 45 ›› Issue (04) : 166-174. DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20230209001

适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺DNA样品的快速制备试剂研究

  • 姚梦丽, 白昌明, 王崇明, 辛鲁生
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摘要

为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题,实现真正的现场快速检测,本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂,即核酸释放剂,适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流层析试纸条技术(lateralflow dipstick, LFD)结合的RPA-LFD技术检测。实验优选20~100 mmol/L Tris-HCl、50~250 mmol/L KCl、0.01%~0.10%十二烷基硫酸锂(LDS)、0.5%~2.0%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、1~5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EGTA2Na)、0.5~5.0 mmol/L牛血清白蛋白(BSA)、1~5 mg/mL明胶、0.01%~0.10%海藻糖、1%~5%甜菜碱等配制成核酸释放剂。以对虾肝肠孢虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)阳性样本和阴性样本对核酸释放剂各组分间配比进行优化,采集绿豆大小的对虾肝胰腺组织加入100μL核酸释放剂,100℃加热3 min,取上清液进行RPA-LFD反应,测试各组分不同浓度配比;并以对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)阳性样品及阴性样品作为检测模板对优化后核酸释放剂再次验证。结果显示,核酸释放剂的各组分最佳配比为100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl、0.02%LDS、0.5%Triton X-100、1 mmol/L EGTA2Na、0.05%海藻糖、1 mg/mL明胶、0.5 mmol/L BSA、2%甜菜碱。RPA-LFD方法检测可显著区分阳性和阴性样品。本研究优化的核酸释放剂,适用于RPA-LFD检测对虾肝胰腺病原DNA样品的制备,有效避免了常规DNA样品繁琐、耗时的制备步骤,极大地提高了核酸水平病原检测效率。

关键词

核酸释放剂 / 重组酶聚合酶扩增(RPA) / 侧流层析试纸条(LFD) / 虾肝胰腺 / 病原快速检测

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姚梦丽, 白昌明, 王崇明, 辛鲁生. 适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺DNA样品的快速制备试剂研究. 渔业科学进展. 2024, 45(04): 166-174 https://doi.org/10.19663/j.issn2095-9869.20230209001

基金

国家自然科学基金(31902400); 广西农产资源化学与生物技术重点实验室开放基金(2022KF07)共同资助

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