The control effect and mechanism of Bacillus velezensis EBV02 on cotton Verticillium wilt

Bai Hongyan,Zhao Lihong,Pu Dandan,Feng Zili,Wei Feng,Feng Hongjie,Gu Aixing,Zhu Heqin,Peng Jun,Zhang Yalin

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Cotton Science ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (5) : 443-457. DOI: 10.11963/cs20220019
DISEASE, PEST AND WEED CONTROL

The control effect and mechanism of Bacillus velezensis EBV02 on cotton Verticillium wilt

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Abstract

[Objective] The purpose of this study was to screen and identify a strain of highly efficient biocontrol bacteria against cotton Verticillium wilt, and to clarify its control mechanism, so as to provide technical support for the disease control. [Method] An endophytic bacterial strain EBV02 against Verticillium dahliae was screened in our laboratory, the species were identified by morphological, physiological, and biochemical characteristics and molecular biological analysis, and its control effect on cotton Verticillium wilt was determined by the indoor bacteriostatic test, greenhouse test, field test, and induced resistance test. The control mechanism of EBV02 was analyzed by measuring the burst of reactive oxygen species, accumulation of callose, and expression of defense-related genes in cotton leaves. [Result] EBV02 was identified as the Bacillus velezensis through morphological observation and molecular biological analysis. The results of confrontation culture and plate-to-plate culture showed that the inhibition rates of EBV02 on mycelium growth of V. dahliae Vd080 were 63.27% and 59.83%, respectively. The inhibition rates of EBV02 on Vd080 sporulation and microsclerotia germination were 31.90% and 45.95%, respectively. In the greenhouse experiment, the highest control effect of EBV02 on cotton Verticillium wilt was 68.33%, and could significantly promote the growth of cotton seedlings. In the field experiment, the control effect of EBV02 fermentation broth spraying on cotton Verticillium wilt was 37.25%. In addition, seed cotton yield and lint yield with EBV02 treatment by seed soaking, root irrigation and spraying of fermentation broth were significantly increased by 8.34% and 8.26%, 3.38% and 5.60%, 7.04% and 7.06%, respectively. In the induced resistance test, EBV02 induced the burst of reactive oxygen species and the accumulation of callose in cotton leaves. The results of gene expression showed that EBV02 induced upregulation of defense-related genes such as POD, PPO, PAL, PR10, and JAR1 in cotton leaves, which enhanced the resistance of cotton to V. dahliae. [Conclusion] EBV02 has a good biocontrol potential of inhibiting the growth of V. dahliae, activating the systemic disease resistance, enhancing the cotton resistance to Verticillium wilt, and increasing the yield in cotton.

Key words

cotton Verticillium wilt / Bacillus velezensis / induced systemic resistance / defense genes / endophytic bacteria

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Hongyan Bai , Lihong Zhao , Dandan Pu , Zili Feng , Feng Wei , Hongjie Feng , Aixing Gu , Heqin Zhu , Jun Peng , Yalin Zhang. The control effect and mechanism of Bacillus velezensis EBV02 on cotton Verticillium wilt. Cotton Science. 2022, 34(5): 443-457 https://doi.org/10.11963/cs20220019
棉花（Gossypium spp.）是重要的天然纤维作物，作为战略物资来源在国民经济中的地位举足轻重。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的一种土传真菌维管束病害，对棉花产量和纤维品质造成了巨大损失。该病原菌能常年存活在土壤中，其寄主范围极广，能够危害多种农作物，且容易产生变异。目前，对黄萎病采取了不同的防治措施，如选择抗病品种、轮作倒茬和化学防治等，但防治效果不理想。因此，亟需找到一种对环境友好且有效的防治方法，生物防治以绿色环保、发展潜力大等优势被人们关注并且应用于实践中。目前，用于防治病害的拮抗微生物有细菌、真菌、放线菌等，其主要通过诱导植物产生系统抗性（induced systemic resistance, ISR），进一步争夺养分和定植空间，或通过产生植物激素和提供营养物质抑制病原侵染、促进植物生长[1]。生防细菌作为生防微生物重要的类群，在病害防治中发挥重要作用，其中以芽孢杆菌（Bacillus sp.）应用较多，如枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、蜡状芽孢杆菌（B. cereus）、短小芽孢杆菌（B. pumilus）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）等。贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）作为芽孢杆菌属的一个新种，在自然界中广泛分布，对人畜无害，对环境无污染，并且能产生对多种病原微生物有拮抗作用的次生代谢物[2]。Martínez-Raudales等[3]发现，B. velezensis 2A-2B能够显著抑制辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的生长，抑制率均在60%以上。此外，贝莱斯芽孢杆菌对一些植物病原细菌也具有较强的拮抗活性。Cui等[4]从马铃薯（Solanum tuberosum）块茎中分离到的贝莱斯芽孢杆菌8-4，对引起马铃薯疮痂病的链霉菌（Streptomyces galilaeus）具有较强的抑菌活性；田间试验结果显示，该菌不仅能够有效控制马铃薯疮痂病的发病率，还能够显著提高马铃薯的产量。可见，贝莱斯芽孢杆菌在农业病害防治方面有较好应用前景。
前期，本团队从健康棉花植株内筛选出一株对棉花黄萎病菌具有拮抗效果的内生细菌菌株EBV02。本研究以该菌株为对象，经菌种鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，进一步分析该菌株对棉花黄萎病菌菌丝生长、产孢量和微菌核萌发的影响，以及对棉花的诱导抗性，以期探明该菌株防治棉花黄萎病的作用机理，从而为研发可用于田间防治棉花黄萎病的微生物菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试内生细菌菌株：EBV02，来自中国农业科学院棉花研究所棉花病害课题组建立的棉花生防菌种群资源库[5-6]；黄萎病菌菌株为大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080[7]，棉花品种为耐黄萎病品种鲁棉研21号[8]，均由中国农业科学院棉花研究所棉花病害课题组提供。
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar, PDA）固体培养基、察氏（Czapek）培养基、卢里亚-贝尔塔尼（Luria-Bertani, LB）固体培养基及液体培养基。

1.2 形态观察和分子生物学鉴定

形态观察和生理生化试验参照汪静杰等[9]的方法。利用Bacterial DNA Kit试剂盒（Omega公司）提取EBV02的基因组DNA，利用16S核糖体DNA（ribosomal DNA, rDNA）的通用引物1492R和27F，以50 μL体系（DNA 1 μL）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，送至上海派森诺生物科技有限公司测序，将测序结果与美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）16S rDNA数据库中的序列进行同源性比对，选出同源性最高且已公布的典型菌株序列，采用Mega 7的邻接法（neighbor-joining method）构建系统发育树，所选模型为Kimura 两参数模型，自展法（Bootstrap）参数（抽样次数）设置为1 000。

1.3 EBV02对大丽轮枝菌拮抗作用的检测

1.3.1 对峙培养法测定EBV02对V. dahliae菌丝生长的影响。EBV02培养液的制备：将筛选到的贝莱斯芽孢杆菌EBV02在LB固体培养基上进行活化，选择单菌落接到LB液体培养基中，置于37 ℃、150 r·min-1摇床培养24 h，获得贝莱斯芽孢杆菌培养液备用（600 nm波长处的吸光值为0.8）。在PDA固体培养基中心接种已经活化的Vd080菌饼（直径5 mm），然后在距离培养基中心20 mm处对称放置2个牛津杯，每杯内加入已经活化的50 μL的EBV02培养液，以接种Vd080不加EBV02培养液作为空白对照，每个处理重复5次。于25 ℃恒温培养箱培养，观察抑菌情况，在第10天，利用十字交叉法测定Vd080菌落直径，计算抑制率（I）。计算公式：I=[（D1-5）-（D2-5）]/（D1-5）×100%[10]。式中，D1和D2分别为空白对照和处理的菌落直径。
1.3.2 对扣培养法测定EBV02对V. dahliae菌丝生长的影响。在PDA固体培养基中心接种已经活化的Vd080菌饼（直径5 mm），在LB固体培养基上接种5 μL已经活化好的EBV02培养液，将上述2个培养基对扣密封，以接种Vd080的PDA培养基和空白LB对扣培养为空白对照，每个处理重复5次。于25 ℃恒温培养箱培养10 d。利用十字交叉法测定Vd080菌落直径，采用1.3.1中公式计算抑制率。
1.3.3 混合培养法测定EBV02培养液对V. dahliae产孢量的影响。取EBV02培养液1 mL与等体积的Vd080孢子悬浮液（含量为1×107 mL-1）混合均匀，置于50 mL离心管中，以无菌LB液体培养基与Vd080孢子悬浮液的等体积混合液为对照，每个处理重复5次，在25 ℃摇床上培养，分别在24 h、48 h和96 h时借助血球计数板计算孢子含量[11]。
1.3.4 混合培养法测定EBV02培养液对V. dahliae微菌核萌发的影响。微菌核的培养及其悬浮液的制备参照Hu等[12]的方法。取100 μL微菌核悬浮液与等体积的EBV02培养液、1/2稀释液和1/4稀释液混合均匀，置于18 ℃暗培养20 h后镜检，检测其萌发情况，计算萌发率，以微菌核悬浮液与无菌LB液体培养基的等体积混合液为对照。每个处理重复5次，每次观察100个微菌核。

1.4 EBV02对棉花生长的影响以及对黄萎病的防治效果

1.4.1 EBV02浸种对棉种萌发的影响。利用高速离心机收集菌体，菌体洗涤3次，溶解在5%（质量分数，下同）羧甲基纤维素钠（carboxyl methyl cellulose sodium, CMC-Na）溶液中制成原液，再制成1/2稀释液和1/4稀释液，备用。将种子消毒后，取50粒棉种在原液、1/2稀释液和1/4稀释液中浸泡12 h，以5% CMC-Na溶液浸种处理为对照，重复5次，25 ℃培养，2 d后检测萌发率和芽长[11]。
1.4.2 温室试验测定EBV02对棉花生长的影响以及对黄萎病的防治效果。浸种法：将蛭石、沙子、营养土按质量比3∶2∶1混合均匀后装入纸钵（直径6 cm，高度10 cm），棉苗培育和Vd080的接种方法参照蛭石沙子无底纸钵定量蘸菌液法[13]。同时，用EBV02培养液浸泡鲁棉研21号棉种12 h，每个纸钵中播种8粒棉种，每6个纸钵为1个处理，每个处理重复3次，以无菌LB液体培养基浸种作为对照。播种后7 d进行间苗，每钵保留5株棉苗。待1片真叶初现时，每个纸钵接种Vd080孢子悬浮液（含量为1×107 mL-1）10 mL，跟踪监测棉花长势情况，适时调查棉花发病情况。
灌根法：温汤（初始温度55 ℃）浸泡鲁棉研21号棉种12 h，棉苗的播种、定苗参照浸种法。待棉花1片真叶初现后，用EBV02培养液灌根，处理后3 d，每个纸钵接种Vd080孢子悬浮液（含量为1×107 mL-1）10 mL，每6个纸钵为1个处理，以等体积无菌LB液体培养基灌根为对照。
接种Vd080孢子悬浮液后15 d参照5级分级标准调查发病情况，同时计算病情指数和防治效果[14-15]。播种后60 d，每个处理随机选取15株棉花测量株高、主根长、鲜物质质量等生物量指标。棉花黄萎病病情指数计算公式为DI=Σ（Ni×i）/（N×4）×100。式中，DI为病情指数，Ni为各级病株数，i为病级数值，N为调查总株数。防治效果（E）计算公式为E（%）=（DI0-DI1）/DI0×100。式中，DI0为对照病情指数，DI1为处理病情指数。
1.4.3 大田试验测定EBV02对棉花生长的影响以及对黄萎病的防治效果。在棉花黄萎病发生严重的病圃中种植耐病品种鲁棉研21号。根据试验设计种植小区，每个小区长3.3 m，宽2.8 m，株距20 cm。试验设置3次重复，3行为1个处理，即9行为1个处理区组。
培养液浸种：取适量消毒后的种子在EBV02培养液中浸种处理12 h，无菌水多次洗涤种子后播种，以无菌LB液体培养基浸种为对照，播种后10 d统计鲁棉研21号种子的出苗数并计算出苗率；出苗后25 d，每个处理随机取15株棉苗，测量主根长、株高、鲜物质质量等指标。培养液灌根：待棉花出苗后，在棉花根部加入EBV02培养液，每小区用量0.8 L，以等体积无菌LB液体培养基灌根为对照。培养液喷雾：将制备好的EBV02培养液喷施在棉苗上，之后每隔20 d喷雾1次，共2次，每小区用量0.4 L，以等体积无菌LB液体培养基喷雾为对照。病情的分级标准、病情指数和防治效果的计算同1.4.2。
棉花收获时调查其株高、单株果枝数、单株结铃数、30铃籽棉质量和30铃皮棉质量。

1.5 EBV02防治棉花黄萎病作用机理探究

1.5.1 EBV02培养液诱导棉花叶片抗性的检测。将消毒后的种子浸泡在已活化好的EBV02培养液中12 h，将种子用无菌水冲洗2~3次，以每钵8粒播种在纸钵中，棉苗长到3片真叶后，用EBV02培养液进行灌根处理，2 d后取棉花真叶进行表面消毒，再用无菌水冲洗2~3次，置于水琼脂培养基表面，将叶片表面造成伤口，在叶片伤口处接种Vd080菌饼。以单独接种无菌LB液体培养基作为对照，每个处理重复5次。25 ℃培养7 d，观察叶片损伤情况[11]。
1.5.2 EBV02培养液诱导棉花叶片活性氧爆发的检测。棉苗长出2片真叶后，用EBV02培养液灌根，每个纸钵10 mL，以接种等量无菌LB液体培养基为对照。接种2 d后，利用3, 3-二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）组织染色法检测棉花叶片中活性氧爆发和积累，取长势相近的棉花真叶，用无菌水洗涤后置于50 mL离心管中，取适量DAB染液（1 g·L-1，pH 7.5）加入离心管中，室温避光染色8 h；去除染液后，加入适量95%（体积分数）乙醇在沸水中水浴2 min脱去叶绿素，去除液体后加适量无水乙醇继续脱色，直至绿色完全脱去。最后将叶片浸泡到70%（体积分数）甘油中，赶出叶片细胞间气泡，将叶片放置到载玻片上采用体式显微镜Leica M165FC进行观察。
1.5.3 棉花叶片胼胝质沉积测定。棉苗长出2片真叶后，用EBV02培养液灌根，在棉花接菌前（对照）以及接菌后48 h分别随机取棉苗5株。取1片完整真叶，在乙醇与乙酸体积比为3︰1的固定液中固定2~3 h，脱去叶绿素。依次在体积分数为70%和50%的乙醇中浸泡3 h，然后于无菌水中浸泡过夜。次日倒掉水后，轻轻漂洗叶片，将叶片在10%（质量分数）NaOH中浸泡1~2 h，使叶片变透明。用蒸馏水清洗叶片4次，随后于0.01%（质量分数）的苯胺蓝染色液中避光培养3 h，最后用荧光体式显微镜Nikon 80i观察胼胝质的积累情况。
1.5.4 棉花防御相关基因表达量的测定。棉花1片真叶初现后，用EBV02培养液灌根，处理后3 d，每纸钵接种10 mL的Vd080孢子悬浮液（含量为1×107 mL-1），每6个纸钵为1个处理，每个处理重复3次，以等体积无菌LB液体培养基灌根为对照。接种Vd080后24 h、48 h和72 h取样。采用RNAprep Pure Plant Kit（天根公司）提取棉花叶片RNA，用NanoDrop 2000检测RNA的质量浓度，并将RNA的质量浓度调到100 mg·L-1，备用。cDNA第1链的合成和荧光定量PCR参照张芸等[16]的方法，检测棉花叶片中防御相关基因过氧化物酶基因（peroxidase gene, POD）、多酚氧化酶基因（polyphenol oxidase gene, PPO）、苯丙氨酸氨裂合酶基因（phenylalanine ammonia-lyase, PAL）、病程相关蛋白10基因（pathogenesis-related protein 10 gene, PR10）和茉莉酸信号转导途径基因JAR1（jasmonate resistant gene 1）的表达量，以棉花中高度保守的基因ubiquitin为内参基因，相关引物见表1。
Table 1 Specific primer sequences of defense-related genes

表1 防御相关基因的特异性引物

基因名 Gene name 引物序列 Primer sequence
POD F: CCGCATAACCATCACAAG R: ACTCTCATCACCTTCAACA
PPO F: ATATCCTTGTTCTGTCTGCTA R: CTCCTTCTACCGTCTCTTC
PAL F: TGGTGGCTGAGTTTAGGAAA R: TGAGTGAGGCAATGTGTGA
PR10 F: ATGATTGAAGGTCGGCCTTTAGGG R: CAGCTGCCACAAACTGGTTCTCAT
JAR1 F: ATGAGGATGTTGGAGAAGAT R: TCAGTTGAAAGCAGTACTAAAGT
ubiquitin F: GAGTCTTCGGACACCATTG R: CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGC
1.5.5 数据处理。试验数据利用Microsoft Excel 2019进行处理，采用IBM SPSS Statistics 26.0统计软件中的单因素方差分析程序进行差异显著性分析。采用邓肯新复极差法比较处理之间的差异显著性（P<0.05）。所有数据在统计分析时，先进行了正态性检验，均符合正态分布。

2 结果与分析

2.1 EBV02的菌种鉴定

EBV02在LB培养基上生长良好，经形态学鉴定，菌落颜色为乳白色，表面光滑，不透明，单菌落形态为球形（图1A）；经革兰氏染色，菌体呈紫红色的短杆状（图1B），确定为革兰氏阳性细菌。根据测序结果与GenBank中相关菌株16S rDNA序列构建系统发育树，其与模式菌株B. velezensis的相似性最高，为99.72%（图1C）。伏-波试验（Voges-Proskauer test, VP test）和硝酸盐还原反应均呈阳性，可以水解淀粉，不能产生H2S。结合其培养特征、生理生化反应和分子生物学鉴定，确定该内生细菌为贝莱斯芽孢杆菌，记为EBV02。
Fig. 1 Species identification of the strain EBV02
A, B: colony and cell morphology of the strain EBV02; C: phylogenetic tree of the strain EBV02 based on the sequence of 16S rDNA.

图1 EBV02的菌种鉴定

A、B：EBV02菌落、菌体形态；C：基于16S rDNA序列构建的EBV02的系统发育树。

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2.2 内生细菌对大丽轮枝菌的拮抗作用分析

2.2.1 EBV02对大丽轮枝菌菌丝生长的抑制作用。对峙培养试验结果（图2A、B）显示，培养10 d后，经EBV02处理的Vd080菌落直径为19.4 mm，未经EBV02处理的Vd080菌落直径为44.2 mm，EBV02对Vd080菌丝生长的抑制率为63.27%。表明，EBV02的非挥发性代谢产物对Vd080的菌丝生长有较强的抑制作用。
Fig. 2 Inhibitory effect of the strain EBV02 on the hyphae of V. dahliae after 10 d of culture
A: blank control of confrontation culture; B: confrontation culture of EBV02; C: blank control of encounter culture; D: encounter culture of EBV02.

图2 培养10 d后EBV02对大丽轮枝菌菌丝的抑制作用

A：对峙培养空白对照；B：EBV02对峙培养；C：对扣培养空白对照；D：EBV02对扣培养。

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对扣培养试验结果（图2C、D）显示：对照中Vd080菌落正常生长的直径为51.3 mm，菌落为白色、无微菌核；而接种EBV02的Vd080菌落上长出了微菌核，菌丝生长被抑制，菌落直径为23.6 mm，抑制率为59.83%。表明，EBV02的挥发性代谢产物对Vd080的菌丝生长也有抑制作用。
2.2.2 EBV02对大丽轮枝菌产孢的抑制作用。产孢量试验结果（图3）显示：在混合培养24 h、48 h和96 h时，EBV02对Vd080的产孢量均有显著抑制作用，抑制率分别为32.24%、41.61%和21.86%；不同培养时间的EBV02培养液对Vd080产孢量的抑制作用有差异，其中混合培养48 h时的抑制效果最好。上述结果表明EBV02培养液对大丽轮枝菌分生孢子的产生具有抑制作用。
Fig. 3 Comparisons of spore production of Verticillium dahliae
* indicates significant difference between the treatment and the control (P < 0.05).

图3 大丽轮枝菌产孢量的比较

*表示处理与对照差异显著（P<0.05）。

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2.2.3 EBV02对大丽轮枝菌微菌核萌发的抑制效果。微菌核与EBV02培养液暗培养20 h的萌发结果（图4）显示：EBV02培养液原液、1/2稀释液和1/4稀释液中混合培养的微菌核萌发率均与对照（41.20%）差异显著，抑制率分别为64.56%、41.75%和31.55%，表明EBV02培养液对微菌核萌发有抑制作用，且抑制作用随着EBV02培养液浓度的增大而增强。
Fig. 4 Comparisons of sclerotium germination rates at 20 h of dark culture
A, B, C represent cultured with stock solution, 1/2-dilution, 1/4-dilution of EBV02 sterile filtrate, respectively; D: LB medium (control). Different letters indicate significant differences (P < 0.05).

图4 暗培养20 h微菌核萌发率比较

A、B、C分别为与EBV02培养液原液、1/2稀释液、1/4稀释液混合培养；D：LB培养基（对照）。字母不同表示差异显著（P<0.05）。

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2.3 EBV02对棉花黄萎病的防治效果

2.3.1 EBV02浸种处理对种子萌发的影响。如表2所示，经过不同浓度菌液浸泡的处理组，棉种萌发率和芽长分别比对照组提高了3.26%和8.50%、3.26%和6.54%、4.88%和16.34%，但差异均不显著。
Table 2 Comparisons of germination rates and shoot length between seed soaking treatments

表2 浸种处理棉种萌发率和芽长比较

处理
Treatment		 萌发率
Germination rate/%		 芽长
Shoot length/cm
EBV02培养液原液 Stock solution of EBV02 culture medium 84.67±0.12 a 1.66±0.15 a
EBV02培养液1/2稀释液 1/2-dilution of EBV02 culture medium 84.67±0.16 a 1.63±0.11 a
EBV02培养液1/4稀释液 1/4-dilution of EBV02 culture medium 86.00±0.18 a 1.78±0.23 a
对照Control 82.00±0.11 a 1.53±0.09 a
注：数据为平均值±标准差；同列数据后字母相同表示差异不显著性（P≥0.05）.
Note: Data are means ± standard deviation; the same letter after the data in the same column indicate no significant differences (P≥0.05).
2.3.2 EBV02对棉花黄萎病的温室防治效果。结果（表3）显示：EBV02浸种处理的发病率和病情指数均显著低于对照，对棉花黄萎病的温室防治效果为68.33%；EBV02灌根处理的棉苗其发病率和病情指数与对照组相比，分别显著降低了24.97%和57.62%。表明，EBV02浸种和灌根处理都可以显著降低棉苗的发病率和病情指数，对棉花黄萎病具有良好的防治效果。此外，与灌根法相比，浸种法对棉花黄萎病的防治效果更好（图5）。
Table 3 Control effect of EBV02 on cotton Verticillium wilt at 15 d after inoculation with V. dahliae in a greenhouse

表3 接种大丽轮枝菌15 d后EBV02对棉花黄萎病的温室防治效果

处理
Treatment		 发病率
Disease incidence/%		 病情指数
Disease index		 防治效果
Control efficacy/%
EBV02浸种Seed soaking with EBV02 10.42±0.23* 10.93±2.41* 68.33±6.98
浸种对照Seed soaking control 31.95±0.28 34.51±4.71
EBV02灌根Root irrigation with EBV02 12.50±0.16* 12.62±6.78* 57.62±2.75
灌根对照Root irrigation control 16.66±0.20 29.78±2.31
注：数据为平均值±标准差，空白表示无此项；*表示处理与对照差异显著（P<0.05）。
Note: Data are means ± standard deviation; blank indicates no such item. * indicates significant difference between the treatment and the control (P < 0.05).
Fig. 5 Control effect of EBV02 treatment on cotton Verticillium wilt in a greenhouse
A: seed soaking control; B: seed soaking with EBV02; C: root irrigation control; D: root irrigation with EBV02.

图5 温室条件下EBV02处理对棉花黄萎病的防治效果

A：浸种对照；B：EBV02浸种处理；C：灌根对照；D：EBV02灌根处理。

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2.3.3 温室环境中不同处理下的棉花生长指标分析。如表4所示，培养液浸种和灌根处理生长25 d的棉苗主根长、株高、地上部鲜物质质量和总鲜物质质量均显著高于对照，增幅分别为62.26%和28.57%、77.77%和34.00%、108.00%和65.43%、103.61%和65.91%，表明EBV02对棉苗的生长发育有促进作用。
Table 4 Comparison of cotton growth indexes of different treatments at 25 d after seedling emergence

表4 出苗后25 d不同处理棉花生长指标的比较

处理
Treatment		 主根长
Main root length/cm		 株高
Plant height/cm		 地上部鲜物质质量
Fresh mass of aerial tissue/g		 总鲜物质质量
Total fresh mass/g
EBV02浸种
Seed soaking with EBV02		 9.20±0.60* 22.63±0.32* 1.56±0.05* 1.69±0.03*
浸种对照
Seed soaking control		 5.67±0.25 12.73±0.37 0.75±0.01 0.83±0.01
EBV02灌根
Root irrigation with EBV02		 7.20±0.16* 13.40±0.24* 1.34±0.02* 1.46±0.01*
灌根对照
Root irrigation control		 5.60±0.27 10.00±0.37 0.81±0.01 0.88±0.01
注：数据为平均值±标准差；*表示处理与对照差异显著（P<0.05）。
Note: Data are means ± standard deviation; * indicates significant difference between the treatment and the control (P < 0.05).
2.3.4 EBV02对棉花黄萎病的大田防治效果。棉花播种后60 d的大田棉苗发病情况调查结果（表5）显示，培养液浸种、灌根和喷雾处理的棉苗发病率和病情指数与对照相比均显著降低，防治效果为23.82%~37.25%。其中，培养液喷雾防治棉花黄萎病效果最好，发病率和病情指数与对照相比分别降低了41.09%和37.25%。
Table 5 Field control effect of the strain EBV02 on cotton Verticillium wilt at 60 d after sowing

表5 棉花播种后60 d EBV02对棉花黄萎病的大田防治效果

处理
Treatment		 发病率
Disease incidence/%		 病情指数
Disease index		 防治效果
Control efficacy/%
EBV02浸种
Seed soaking with EBV02		 11.11±0.69* 16.47±0.20* 23.82±0.92
浸种对照
Seed soaking control		 15.28±1.39 21.62±0.91
EBV02灌根
Root irrigation with EBV02		 28.47±1.83* 13.38±0.09* 27.83±0.52
灌根对照
Root irrigation control		 33.34±2.08 18.54±2.45
EBV02喷雾
Spraying with EBV02		 29.86±1.84* 13.66±0.29* 37.25±1.33
喷雾对照
Spraying control		 50.69±1.39 21.77±0.15
注：数据为平均值±标准差，空白表示无此项；*表示处理与对照差异显著（P<0.05）。
Note: Data are means ± standard deviation; blank indicates no such item. * indicates significant difference between the treatment and the control (P < 0.05).
2.3.5 浸种处理的大田棉花出苗率及生长指标分析。由表6可知，与对照相比，EBV02浸种处理的棉花出苗率显著提高，增幅为6.40%，棉苗的地上部鲜物质质量和总鲜物质质量分别显著增加8.41%和7.67%，表明EBV02浸种处理有利于棉苗的物质积累。此外，EBV02处理的棉苗主根长、株高与对照均无显著差异。
Table 6 Comparisons of cotton emergence rates and growth indexes between seed soaking treatments

表6 浸种处理棉花出苗和生长指标的比较

处理Treatment 出苗率
Emergence rate/%		 主根长
Main root length/cm		 株高
Plant height/cm		 地上部鲜物质质量
Fresh mass of aerial tissue/g		 总鲜物质
质量
Total fresh mass/g
EBV02浸种
Seed soaking with EBV02		 61.00±3.79* 6.82±0.22 20.76±0.49 37.26±0.28* 40.70±0.76*
浸种对照
Seed soaking control		 57.33±2.91 6.72±0.32 20.13±0.47 34.37±0.60 37.80±0.71
注：数据为平均值±标准差；*表示处理与对照差异显著（P<0.05）。
Note: Data are means ± standard deviation; * indicates significant difference between the treatment and the control (P < 0.05).
2.3.6 EBV02对大田棉花产量相关性状的影响。如表7所示，EBV02培养液浸种、灌根和喷雾处理均能显著增加收获期棉花的株高、30铃籽棉质量和30铃皮棉质量。其中，浸种、灌根和喷雾处理的30铃籽棉质量和30铃皮棉质量与对照相比分别增加12.60 g和5.00 g、5.53 g和3.47 g、11.53 g和4.47 g，增幅分别为8.34%和8.26%、3.38%和5.60%、7.04%和7.06%。
Table 7 Comparisons of cotton yield and yield-related traits between EBV02 treatment and control under field conditions

表7 大田条件下不同 EBV02处理与对照棉花产量及产量相关性状的比较

处理
Treatment		 株高
Plant height/cm		 单株果枝数
Number of fruit branches per plant		 单株结铃数
Number of bolls per plant		 30铃籽棉质量
Seed cotton mass of 30 bolls/g		 30铃皮棉质量
Lint mass of 30 bolls/g
EBV02浸种
Seed soaking with EBV02		 79.87±1.07* 15.07±0.35 10.53±2.40 163.60±0.56* 65.50±1.63*
浸种对照
Seed soaking control		 71.20±4.02 14.07±0.29 9.60±0.20 151.00±2.05 60.50±1.47
EBV02灌根
Root irrigation with EBV02		 83.07±1.27* 16.00±1.31 13.87±1.17 169.33±2.05* 65.40±1.33*
灌根对照
Root irrigation control		 77.87±0.74 15.33±0.35 12.07±1.27 163.80±1.93 61.93±0.90
EBV02喷雾
Spraying with EBV02		 73.87±0.84* 15.80±0.35* 13.13±0.32* 175.30±2.17* 67.80±0.79*
喷雾对照
Spraying control		 70.47±0.07 13.87±0.18 9.13±0.07 163.77±2.88 63.33±1.70
注：数据为平均值±标准差；*表示处理与对照存在差异显著（P<0.05）。
Note: Data are means ± standard deviation; * indicates significant difference between the treatment and the control (P < 0.05).

2.4 EBV02防治棉花黄萎病的作用机理探究

2.4.1 EBV02培养液诱导棉花抵御大丽轮枝菌。将棉花真叶在水琼脂培养基表面培养7 d后，EBV02培养液灌根处理的叶片表面菌丝附着较少，而灌根对照的叶片表面有大量菌丝定植，坏死面积较大，且叶片损伤程度更严重（图6）。
Fig. 6 Performance of EBV02 enhanced cotton leaves against V. dahliae
A: Root irrigation control; B: root irrigation with EBV02.

图6 EBV02诱导棉花叶片抗大丽轮枝菌表现

A：灌根对照；B：EBV02灌根处理。

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2.4.2 EBV02培养液诱导棉花叶片活性氧爆发。镜检结果（图7）表明，经EBV02培养液灌根处理的棉花叶片中褐色沉淀较多，而在对照中，褐色沉淀较少，表明EBV02诱导了棉花叶片中活性氧爆发。
Fig. 7 Performance of EBV02 triggered the burst of reactive oxygen species in cotton
A: Root irrigation control; B: root irrigation with EBV02.

图7 EBV02引起棉花叶片活性氧爆发表型

A：灌根对照；B：EBV02灌根处理。

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2.4.3 棉花叶片中胼胝质沉积对比。镜检结果（图8）表明，接种EBV02培养液2 d后，经EBV02灌根处理的棉花叶片中胼胝质的积累量较多，而在对照中胼胝质的积累量较少，表明EBV02诱导了棉花叶片中胼胝质的积累。
Fig. 8 EBV02 induced callose accumulation in cotton leaves
A: Root irrigation control; B: root irrigation with EBV02.

图8 EBV02诱导棉花叶片胼胝质的积累

A：灌根对照；B：EBV02灌根处理。

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2.4.4 EBV02诱导棉花防御相关基因的表达分析。基因表达量检测结果（图9）表明，经过EBV02培养液灌根处理后，叶片中POD、PPO、PAL、PR10和JAR1基因的表达量均升高。PAL和PR10在接种后24 h的表达量分别是对照组的1.80倍和1.32倍，在接种后72 h分别是对照组的21.35倍和108.00倍。表明EBV02灌根处理能激活棉花的防御系统，增强其对棉花黄萎病的抵抗能力。
Fig. 9 The expression levels of defense-related genes
A-E: the relative expression levels of POD, PPO, PAL, PR10, JAR1; control meant cotton first treated with LB medium, and then inoculated with Vd080. EBV02 meant cotton first treated with EBV02 culture solution and then inoculated with Vd080. * indicates significant difference between the treatment and the control (P<0.05).

图9 防御相关基因表达量检测结果

A~E：POD、PPO、PAL、PR10、JAR1基因的相对表达量；对照为先用LB处理后接种Vd080；EBV02为先用EBV02培养液处理后接种Vd080；*表示处理与对照差异显著（P<0.05）。

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3 讨论

利用拮抗微生物及其代谢产物来抑制植物病原菌的发生和危害，是绿色环保的防治策略。目前，研究发现贝莱斯芽孢杆菌对多种植物病原菌具有抑制作用，例如贝莱斯芽孢杆菌DPT-03对花生白绢病的防治效果达到了62.50%，可以有效抑制病原菌菌丝生长和微菌核的形成，抑制率高达87.20%~88.51%，显著降低花生白绢病的发病率和发病程度，且提高花生产量[17]。本研究从棉花的内生细菌EBV02入手，经形态特征、生理生化特征和分子生物学鉴定，明确EBV02为贝莱斯芽孢杆菌。通过对峙培养和对扣培养试验，发现EBV02对大丽轮枝菌Vd080菌丝生长的抑制率分别为63.27%和59.83%；EBV02培养液对Vd080产孢量和微菌核萌发的平均抑制率分别为31.90%和45.95%；对棉花黄萎病菌温室防治效果高达68.33%，并能激活棉花抗病防御系统。
目前，对内生菌生防潜力的测定绝大多数在实验室或温室进行，在田间进行的较少。室内筛选出对病原菌拮抗效果较强的生防菌株，在大田中常出现防治效果不稳定的情况[18]。温室试验中，采用EBV02培养液浸种和灌根处理对棉花苗期黄萎病均表现出较好的防治效果（57.62%~68.33%），但是大田防治效果仅为23.82%~37.25%，分析其原因可能是内生菌是一个生物活体，大田环境中的一些生物和非生物因素都会影响其防治效果[19]。董玉洁[20]用生防菌链霉菌GX-8处理苦瓜幼苗，与对照相比，株高增加60.00%，茎粗增加12.00%，鲜物质质量增加54.05%，干物质质量增加20.59%。有研究已证实生防菌可以提高棉花产量、株高、单株结铃数、单株果枝数等[16]。温室试验中经EBV02培养液处理的棉花，其主根长、株高、地上部鲜物质质量和总鲜物质质量均显著高于对照组，对棉苗生长具有较好的促生作用。大田试验中EBV02培养液浸种、灌根和喷雾处理对棉花的籽棉和皮棉增产效果显著。这些结果表明，贝莱斯芽孢杆菌EBV02不仅能够防控棉花黄萎病，还能够明显提高棉花产量。
生防菌的诱导抗性作用须与竞争作用、重寄生作用、拮抗作用以及植物促生作用以及其他作用机制共同协作才能发挥增效作用[21]。活性氧在调节植物生长和增强抗逆性方面具有重要作用[22]，胼胝质被视为植物抵抗病原菌的物理屏障[23]。EBV02培养液灌根处理，可显著抑制大丽轮枝菌对棉花叶片的侵染，促进棉花叶片活性氧爆发和胼胝质积累，减少大丽轮枝菌在叶片中的定植。苯丙氨酸解氨酶是合成木质素、酚类物质等抑菌物质的关键酶，对植物抗病系统的激活至关重要[24]。PR10是植物在受到各种生物和非生物胁迫后产生的一类病程相关蛋白，在植物的发育和对外界逆境环境的应激反应中发挥重要作用[25]。本研究发现，EBV02培养液灌根处理可诱导PAL、POD、PPO、PR10和JAR1的显著上调表达。综上，贝莱斯芽孢杆菌EBV02能够诱导棉花对大丽轮枝菌产生系统抗性，具有较好的防病效果。但本研究对其防病机理只是初步探讨，对其更深层次的作用机理包括其中的信号转导途径还有待进一步研究。

4 结论

筛选并鉴定了内生细菌贝莱斯芽孢杆菌EBV02，其非挥发性代谢产物能有效抑制棉花黄萎病菌Vd080的菌丝生长、分生孢子的产生和微菌核的萌发，挥发性代谢产物也可以抑制Vd080菌丝的生长；温室和大田试验表明，施用EBV02能降低黄萎病发病率和病情指数，且对棉苗生长发育及产量具有促进作用。此外，EBV02可提高棉花叶片抵抗黄萎病菌侵染的能力，引起叶片活性氧爆发、胼胝质积累和防御基因的上调表达，表明EBV02能诱导棉花对黄萎病的系统抗性。综上所述，EBV02在防治棉花黄萎病方面具有较好的应用前景，可为研发微生物菌剂提供参考。

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