植物磺化肽激素受体(PSK receptor,PSKR)在促进植物细胞增殖和非生物胁迫中起着重要作用。为了探讨小麦PSKR的序列特征和生物学功能,采用同源克隆技术,从普通小麦品种晋麦47根组织中克隆出TaPSKR1 3个部分同源基因的cDNA序列,因3个基因分别位于6A、6B和6D染色体上,故分别命名为TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D。并且利用生物信息学手段对其基因结构、蛋白理化性质、顺式作用元件、功能结构域及系统进化树进行分析,通过qRT-PCR分析TaPSKR1基因在不同组织以及不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,TaPSKR1-6A、TaPSKR1-6B和TaPSKR1-6D均包含一个外显子,其开放阅读框分别为3 153,3 132,3 156 bp,分别编码1 050,1 043,1 051个氨基酸。生物信息学分析结果表明,TaPSKR1定位在细胞膜上,具有信号肽、跨膜结构域和8个LRRs结构域及胞内激酶结构域,属于PSKR家族成员。系统进化显示,TaPSKR1蛋白与小麦近缘物种及水稻亲缘关系较近,处于同一分支上。实时定量PCR分析结果表明,TaPSKR1基因在根、茎、叶片、穗和种子中均有表达,在根中的表达量极高;逆境胁迫分析表明,干旱和盐胁迫处理下,叶片中TaPSKR1的3个部分同源基因的表达急剧上调,推测TaPSKR1可能在小麦抵抗逆境胁迫过程中起重要的调控作用。

为研究Osp39基因在水稻叶绿体蛋白质输入调控过程中的作用,采用生物信息学方法对水稻的Osp39基因进行了序列搜索和启动子上游元件分析,对其编码的OsP39蛋白进行了同源性比对、结构和性质预测,并分别通过定量PCR和瞬时表达进行了基因的组织表达分析和蛋白质亚细胞定位分析。结果显示,Osp39基因位于水稻5号染色体,基因编码区含11个外显子,无可变剪切方式。Osp39启动子中含有I box、ATCT-motif等多种光响应和叶绿体调节元件,转录分析也显示,在苗期和扬花期,Osp39基因在水稻叶、叶鞘等绿色组织中的转录水平均极显著高于根、花等非绿色组织。OsP39蛋白稳定性好,耐热,分子量约38.7 ku,理论等电点pH值 8.64,共含有361个氨基酸残基,富含甘氨酸,第245-271氨基酸残基形成高度保守的L6 loop区,为OMP85蛋白家族的特征性结构域,空间结构预测显示,OsP39蛋白是富含β-折叠片的β-桶状膜蛋白,亚细胞定位结果显示,OsP39蛋白定位于水稻叶绿体膜。上述结果表明,Osp39是一个叶绿体膜功能相关基因,参与水稻的光响应和叶绿体功能调节。

为探究大豆转录因子GRAS家族GmGRAS69基因在植物干旱胁迫中的功能和可能的分子机制。通过氨基酸序列比对和构建系统进化树分析大豆GmGRAS69与其他物种GRAS成员的序列保守性和进化关系。利用荧光定量PCR方法检测GmPP2C69基因在PEG处理的大豆根和叶中的表达模式。接着构建GmPP2C69基因过表达载体,进而利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥;在正常培养和干旱处理条件下观察野生型和转基因拟南芥的生长表型,测定单株鲜质量、叶片相对含水量和地上部可溶性糖含量、抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性及对应的抗氧化酶基因表达水平。结果显示,GmGRAS69基因在PEG处理的大豆植株根和叶中都显著上调,并且在根中响应更显著。此外,成功获得GmGRAS69基因过表达的转基因拟南芥株系,且过表达株系的耐旱性相比野生型拟南芥WT明显增强。干旱处理后,过表达植株鲜质量、叶片相对含水量和可溶性糖含量均显著高于WT;抗氧化酶SOD、POD和CAT活性以及对应基因SOD、POD和CAT的表达水平也显著高于WT。结果表明,大豆GmGRAS69基因在干旱胁迫下表达上调,进而通过激活SOD、POD和CAT抗氧化酶编码基因、增强抗氧化酶活性和增加可溶性糖的积累,赋予转基因植株更强的耐旱性。

FLK(Flowering Locus KH Domain)基因在植物开花调控过程中具有重要的作用,其功能在模式植物拟南芥中已经鉴定。为揭示大豆GmFLK基因功能,从大豆Williams 82中克隆获得GmFLK基因,并对其编码蛋白进行结构分析和生物信息学分析。在烟草叶片中检测该蛋白的亚细胞定位情况,在大豆中分析其表达模式。结果表明,GmFLK基因全长6 806 bp,含有6个外显子,5个内含子,CDS序列长1 341 bp,编码446个氨基酸。蛋白分子量大小为47.031 ku,等电点为5.46。GmFLK蛋白中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲所占比例分别为24.44%,14.80%和60.76%。进化分析结果显示,GmFLK与Glyma.03g248200同源关系最近,其次为苜蓿Medtr7g115340、花生ArahyQL2VNI、 ArahyUPVY9X和拟南芥AtFLK。亚细胞定位结果表明,GmFLK蛋白在细胞核、细胞质和细胞膜中均有表达。GmFLK基因启动子区域含有10类顺式作用元件,其中6类与光反应有关。GmFLK基因在花、叶、根、种子和茎中均有表达,其中在叶和种子中表达相对较高,在花中表达相对较低。GmFLK基因在长日照和短日照条件下表达模式相似,但在一天中不同时间点表达不同,在光照后4 h表达相对较低,在光照后0,12 h表达相对较高,由此推测,大豆GmFLK基因可能参与大豆开花调控途径。

为探究TaTLP8类甜蛋白在小麦抵御叶锈菌侵染过程中的功能,以小麦近等基因系TcLr26及其轮回亲本Thatcher(Tc)为材料,分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和与亲和组合。经生物信息学分析、原核表达、亲和层析、动物免疫,制备了TaTLP8的兔源多克隆抗体,并使用制备的抗体,对小麦与叶锈菌互作的不亲和与亲和组合中TaTLP8的表达情况进行了分析。结果表明,小麦TaTLP8与大麦HvTLP8同源性较高且N-端含有信号肽。以无信号肽区段的TaTLP8基因(TaTLP8-nosp)构建重组质粒pET28a-TaTLP8-nosp,并以0.100 mmol/L的最适浓度IPTG对该蛋白在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。以纯化后的TaTLP8-nosp重组蛋白免疫新西兰兔制备了抗体。Western Blotting检测发现,该抗体可与小麦中TaTLP8蛋白特异性结合。使用制备的抗体检测了小麦-叶锈菌不同亲和性组合中TaTLP8的表达水平,发现TaTLP8在不亲和组合中自接种叶锈菌8 h后启动表达,其表达量逐渐升高;在亲和组合中,直至叶锈菌接种后48 h才检测到TaTLP8的蛋白信号,并且其表达水平逐渐下降。总体而言,TaTLP8在不亲和组合中的表达水平高于亲和组合,说明TaTLP8在小麦抵御叶锈菌侵染的过程中可能发挥正调控作用。

为进一步探究小麦的TaGAMyb-B不同等位变异基因对茎秆伸长的作用,利用水稻的农杆菌转化体系、RT-qPCR、组织切片和细胞组织特异性分析等方法系统研究TaGAMyb-B基因不同等位变异中84 bp InDel 的功能。结果发现:在TaGAMyb-B超表达的水稻转基因株系中,该基因在种子、根、茎以及叶中均有表达; 转TaGAMyb-Ba-GFP和TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻T₂种子在应对外界NaCl、GA和甘露醇胁迫处理时,其表现的敏感性为TaGAMyb-Bb-GFP大于TaGAMyb-Ba-GFP;转TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻的第一、二和三茎粗,穗长和分蘖数均显著小于转TaGAMyb-Ba-GFP基因型;转基因水稻后代第二茎间的细胞组织切片分析表明:转TaGAMyb-Ba-GFP基因型水稻横切面厚壁组织细胞的平均厚度显著大于转TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻,并且其厚壁细胞的平均长度极显著小于转TaGAMyb-Bb-GFP基因型水稻。以上结果表明,TaGAMyb-B不同等位变异中84 bp序列缺失在转基因水稻中除了增加非生物胁迫抗性和抗倒伏性功能外,还显著增加了穗长和分蘖数。

为了研究棉花中AOP2-like(GhAOP2-like)与抗旱耐盐的相关性,根据河北省农林科学院棉花研究所遗传育种研究室前期获得的蛋白质组数据,利用同源克隆法得到了GhAOP2-like的基因序列,用生物信息学方法对GhAOP2-like蛋白的理化性质、结构、亚细胞定位等进行了分析,利用qRT-PCR技术检测了GhAOP2-like的组织特异性表达以及在干旱、盐和激素处理下的表达量变化。结果显示,GhAOP2-like位于D13染色体上,CDS序列长972 bp,编码323个氨基酸。生物信息学分析发现,GhAOP2-like蛋白的分子式为C₁₆₅₄H₂₅₂₅N₄₂₉O₄₇₈S₁₉,理论等电点为5.20,不含信号肽和跨膜结构域,定位于细胞质中。聚类分析结果显示,棉花与其他物种中的AOP序列被明显分成2组,但与木槿中AOP序列关系最近。根据qRT-PCR的结果,发现GhAOP2-like在根、茎、叶和发育中的种子中都表达,但在根中表达量最高,并且在干旱、盐、GA₃、MeJA和ABA处理下上调表达,但在MeJA处理下表达变化最强烈,说明GhAOP2-like可能通过参与茉莉酸信号通路调节根系的生长从而提高陆地棉的抗逆性。

为进一步探究水稻多胚候选基因OsPE的生物学功能,以粳稻品种日本晴和籼稻品种巴斯马蒂370为研究材料,选取正常生长条件下供试材料的成熟叶片,综合运用生物信息学、RT-PCR、TA克隆、半定量及qPCR等技术鉴定并分析水稻多胚候选基因OsPE的可变剪接体。结果表明,虽然生物信息学分析显示OsPE基因在粳稻中存在3种可变剪接体,在籼稻中无可变剪接体,但通过特异引物进行RT-PCR扩增,结合TA克隆及测序验证,在粳稻品种日本晴中鉴定到了OsPE基因3种可变剪接体的真实存在;在籼稻品种巴斯马蒂370中鉴定到2种新的可变剪接体。同时,半定量及qPCR结果显示:正常生长条件下,供试材料成熟叶片中OsPE基因可变剪接体存在表达差异,依次为OsPEc>OsPEa>OsPEb,且该基因在不同水稻品种中存在相同的表达趋势。最后,水稻OsPE基因编码蛋白进化分析及功能预测分析结果显示:OsPE蛋白在禾本科,尤其是稻属中高度保守(蛋白序列一致性普遍高于99%),有待于进一步研究该基因是否参与调控水稻抗逆响应、细胞分裂及细胞凋亡等生物学功能,而不是调控水稻多胚产生。综上所述,OsPE基因在禾本科,尤其是稻属中高度保守,该基因在粳稻和籼稻中可能有着相同的剪接模式,其可变剪接体在正常生长条件下存在表达差异,但表达趋势相同,OsPEc剪接体在OsPE基因功能发挥中占主导,有待于进一步研究该基因是否参与调控水稻抗逆响应、细胞分裂及细胞凋亡等生物学功能,而不是调控水稻多胚产生。

为探究航天诱变小麦突变体的真伪,以实践十号卫星搭载创制的周麦18 SP₅突变群体为材料,对其籽粒表型进行分析,同时采用42对SSR标记和55K SNP芯片技术对籽粒表型差异较为显著的4个突变体进行真实性鉴定。籽粒表型分析发现,突变群体的千粒质量、粒长差异显著,其中千粒质量变异最为丰富,粒宽差异不显著,且突变群体的平均粒长、粒宽和千粒质量均显著高于野生型,说明航天诱变的有益突变频率较高。SSR标记鉴定发现,突变体ZM18-112与野生型的差异标记为18个,多态性比例高达42.85%,而ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7与其野生型的差异标记均不超过3个。SNP芯片鉴定发现,ZM18-112与野生型的差异SNP位点所占比例高达13.3012%,而其他3个突变体与野生型的差异SNP位点所占比例不超过0.7689%。认为突变体ZM18-112是由于异花授粉或机械混杂产生的假突变体,而ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7与野生型的遗传背景基本一致,是经过航天诱变而产生的真实突变体。