水稻Osp39基因的组织表达和亚细胞定位分析

腾海艳

华北农学报. 2023, 38(3): 10-17

华北农学报 ›› 2023, Vol. 38 ›› Issue (3) : 10-17. DOI: 10.7668/hbnxb.20193511
作物遗传育种·种质资源·生物技术

水稻Osp39基因的组织表达和亚细胞定位分析

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Tissue Expression and Subcellular Localization of Osp39 Gene in Rice

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摘要

为研究Osp39基因在水稻叶绿体蛋白质输入调控过程中的作用,采用生物信息学方法对水稻的Osp39基因进行了序列搜索和启动子上游元件分析,对其编码的OsP39蛋白进行了同源性比对、结构和性质预测,并分别通过定量PCR和瞬时表达进行了基因的组织表达分析和蛋白质亚细胞定位分析。结果显示,Osp39基因位于水稻5号染色体,基因编码区含11个外显子,无可变剪切方式。Osp39启动子中含有I box、ATCT-motif等多种光响应和叶绿体调节元件,转录分析也显示,在苗期和扬花期,Osp39基因在水稻叶、叶鞘等绿色组织中的转录水平均极显著高于根、花等非绿色组织。OsP39蛋白稳定性好,耐热,分子量约38.7 ku,理论等电点pH值 8.64,共含有361个氨基酸残基,富含甘氨酸,第245-271氨基酸残基形成高度保守的L6 loop区,为OMP85蛋白家族的特征性结构域,空间结构预测显示,OsP39蛋白是富含β-折叠片的β-桶状膜蛋白,亚细胞定位结果显示,OsP39蛋白定位于水稻叶绿体膜。上述结果表明,Osp39是一个叶绿体膜功能相关基因,参与水稻的光响应和叶绿体功能调节。

Abstract

To explore the role of Osp39 gene in the regulation of rice chloroplast protein import, the sequence of Osp39 gene and upstream elements in its promoter were searched and analyzed by using bioinformatics assay,and the homology,properties and structure of the OsP39 protein were also carried out.The tissue expression of Osp39 gene and subcellular localization of OsP39 protein were analyzed by quantitative PCR and transient expression in protoplasts,respectively.The results showed that the Osp39 gene was located on chromosome 5 of rice.There were 11 exons in the coding region of Osp39 gene,and its transcription product had no alternative splicing mode,so there was only one type of transcription product.The Osp39 promoter contained a variety of light-responsive and chloroplast regulatory elements such as I box and ATCT-motif.Transcriptional analysis of Osp39 gene also showed that the transcription level of Osp39 gene in green tissues such as leaf and leaf sheath was significantly than that in non-green tissue such as root and flower during seeding and flowering stages.OsP39 protein was stable and heat-resistant,which molecular weight was about 38.7 ku and theoretical isoelectric point was pH 8.64.There were a total of 361 amino acid residues in OsP39 protein,of which the content of glycine was the highest.The 245-271 amino acid residues formed a highly conserved L6 loop region,which belonged to the characteristic domain of the OMP85 protein family.Spatial structural analysis revealed that OsP39 was a β-barrel membrane protein rich in β-sheets.Subcellular localization analysis showed that OsP39 protein was localized at the rice chloroplast membrane.The above results indicated that Osp39 gene was a chloroplast membrane related gene,which was involved in the regulation of light response and chloroplast function in rice.

关键词

水稻 / Osp39基因 / 生物信息学 / 组织表达 / 亚细胞定位

Key words

Rice / Osp39 gene / Bioinformatics / Tissue expression / Subcellular localization

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腾海艳. 水稻Osp39基因的组织表达和亚细胞定位分析. 华北农学报. 2023, 38(3): 10-17 https://doi.org/10.7668/hbnxb.20193511
Haiyan TENG. Tissue Expression and Subcellular Localization of Osp39 Gene in Rice. Acta Agriculturae Boreali-Sinica. 2023, 38(3): 10-17 https://doi.org/10.7668/hbnxb.20193511
P39蛋白又称SP2(Suppressor of ppi1 locus 2)蛋白[1]或OEP80(Outer envelope protein 80),属于OMP85(Outer membrane protein of 85 ku)蛋白家族[2],该家族成员定位于叶绿体、线粒体膜或细菌细胞膜,参与蛋白质跨膜转运或膜上定位[2-2]。大部分OMP85蛋白由C端β-桶状跨膜结构域和N端多肽转运结合(Polypeptide transport associated,POTRA)结构域组成,β-桶状跨膜结构域是蛋白质通道,POTRA结构域的作用类似分子伴侣,能够结合被转运的蛋白质并将其传递到内膜[4],但是P39蛋白及其同源蛋白P36缺少POTRA结构域[3]。在拟南芥中,P39蛋白定位于叶绿体外膜[3],Hsueh等[5]发现,P39蛋白影响成熟拟南芥的代谢稳态,p39基因突变后,拟南芥成熟植株的光合活性和类囊体结构均发生改变,多条代谢途径出现异常。根据Ling等[1]的报道,拟南芥通过SP1蛋白、P39蛋白和CDC48(Cell division cycle 48)蛋白协作,促进叶绿体外膜转运蛋白的泛肽化和降解,从而控制外源蛋白质向叶绿体的输入,此过程称为叶绿体相关蛋白降解(Chloroplast-associated protein degradation,CHLORAD)机制,该机制不仅参与叶绿体蛋白的输入调控和氧化胁迫响应[1],在番茄中,还参与番茄有色体的发育,从而影响果实的成熟过程[6]。
蛋白质的输入调控影响着质体的功能和植物的光合效率,在农作物中,叶绿体和有色体的蛋白质输入调控还将影响到作物的产量、抗逆性及农产品品质[6⇓-8]。在前期工作中,已经对CHLORAD机制中的sp1基因在水稻中的同源基因OsSP1(登录号:Os07g0647800)进行了研究,并发现该基因的CRISPR/Cas9基因编辑水稻植株具有严重的生长抑制表型,显示了叶绿体蛋白输入调控途径对水稻生长发育的重要影响[9-10]。为继续探究水稻的CHLORAD机制,本研究选择p39基因在水稻中的同源基因Osp39作为研究对象,通过生物信息学手段以及转录分析、原生质体瞬时表达等方法,确定该基因及其编码蛋白的结构和性质特征、组织表达情况及亚细胞定位情况,为深入研究Osp39基因的功能,进而为阐明水稻叶绿体蛋白质输入调控机制提供基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料及生长条件

本研究使用的水稻(Oryza sativa L.)为粳稻品种中花11,亚细胞定位、组织表达使用的土培和水培试验材料均种植于宜春学院苗圃,4-7月份自然温度和光照条件下生长,水培材料每3 d更换1次木村B营养液,常规管理。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒和DNA回收试剂盒购自Magen公司,反转录试剂和DNA聚合酶购自诺唯赞公司,2×SYBR mix、EcoR Ⅰ和HindⅢ限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司,原生质体制备使用的纤维素酶和离析酶购自Yakult公司,其他木村B营养液配制、凝胶电泳、原生质体制备、转化等试剂均为国产分析纯。

1.3 Osp39基因及其蛋白产物的生物信息学分析

基于拟南芥p39基因的mRNA序列及AtP39蛋白的氨基酸序列,在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站通过Blast工具搜索水稻中的同源基因Osp39的mRNA序列和完整基因序列,以及水稻、玉米、大豆等共12 种植物的P39蛋白质序列。PLACE数据库和PlantCARE数据库进行启动子顺式作用元件分析,DNAMAN软件进行蛋白质氨基酸序列同源性分析,MEGA软件构建系统进化树,Expasy-ProtParam数据库进行蛋白质理化性质分析,SignalP数据库进行蛋白质信号肽预测,TMHMM数据库进行蛋白质跨膜区位置预测,SOPMA数据库进行二级结构元件分析,SWISS-MODEL数据库进行蛋白质空间结构预测,STRING数据库进行蛋白质互作分析,PredictProtein数据库进行亚细胞定位预测。

1.4 RNA提取和定量PCR分析

苗期水稻样品取自木村B营养液培养14 d的水稻苗,分别取根(叶鞘下约5 cm长)、叶鞘和由上至下第2 片叶片,扬花期水稻取自土培的扬花期水稻植株,分别取旗叶中段、茎和花(包括雌蕊、雄蕊和颖壳),每种样品均平行取样3 份,混合,快速放入液氮中,经试剂盒提取总RNA,反转录获得cDNA后,以cDNA作为模板,进行Osp39基因和内参基因OsActin1(登录号:Os03g07181000)的定量PCR扩增。定量PCR反应程序:95 ℃,3 min;95 ℃,15 s,60 ℃,30 s,40次循环。定量PCR反应体系:2×SYBR mix 5.0 μL;F、R引物(10 μmol/L)各0.5 μL;cDNA 1.0 μL;双蒸水补至10.0 μL。PCR结果用2-ΔΔCt法[11]进行计算,SPSS软件进行显著性分析。定量PCR引物序列见表1。
表1 PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences for PCR

引物名称
Name of primer		 序列(5'-3')
Sequence(5'-3')		 用途
Application
Osp39-F GGTAGCGTACGGGGTTATGG 定量PCR
Osp39-R ACCAGGGACATGACAAGCAG 定量PCR
OsActin1-F CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA 定量PCR
OsActin1-R CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA 定量PCR
Osp39-EcoR Ⅰ-F TGCAGAATTCATGGGAGCTCAGCAGAGC 片段扩增
Osp39-Hind Ⅲ-R TCAGAAGCTTTGAACCGCCACCACTGTT 片段扩增

1.5 Osp39-gfp瞬时表达载体的构建

以1.4中获得的cDNA作为模板,扩增不含终止密码子的Osp39编码序列,PCR产物经凝胶电泳检测,DNA试剂盒回收后,采用酶切、连接法将酶切产物克隆到pOX载体的gfp序列上游的多克隆位点,构建OsP39蛋白与GFP蛋白的融合表达载体并转化大肠杆菌TOP10菌株。PCR扩增引物见表1。

1.6 亚细胞定位分析

一叶期土培水稻幼苗,取约5 cm长的叶鞘部分制备水稻原生质体[12],将OsP39蛋白与GFP蛋白的融合表达载体质粒转入原生质体,同时转化GFP蛋白的载体质粒作为对照,室温避光孵育过夜后,激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss,LSM7 DUO)观察绿色荧光蛋白GFP在细胞内的定位情况。

2 结果与分析

2.1 Osp39基因的结构

在NCBI数据库通过Blast功能获得水稻Osp39基因序列,结果显示,Osp39基因位于水稻5号染色体,基因登录号为Os05g0510200,基因编码区共有11个短外显子,L6 loop区保守序列的编码区位于第9外显子上,转录产物无可变剪切方式(图1),成熟mRNA的编码区长1 086 bp,使用该编码区序列进行Blast,在水稻基因组中未找到其他功能相关的同源序列。
图1 Osp39基因结构
下括号位置为 L6 loop区编码位点。

Fig.1 Structure of Osp39 gene

The position of the lower bracket is the coding site of L6 loop.

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2.2 Osp39启动子的上游元件

从Osp39基因起始密码子ATG前面截取长度为2 200 bp的上游启动子序列,使用PLACE数据库和PlantCARE数据库进行启动子顺式作用元件分析,结果显示,Osp39启动子中含有I box、ATCT-motif、CPBCSPOR等多个光响应元件和叶绿体调控位点,此外还有TGACG-motif等多个激素响应元件,多个MYB转录因子识别和结合位点及ARE、LTR等厌氧和低温响应元件(表2),这些上游元件调节不同生长状态和环境条件下基因的转录水平,是基因表达调控的重要元件。
表2 Osp39启动子中的上游元件

Tab.2 Upstream elements in Osp39 promoter

元件名称
Name of element		 序列(5'-3')
Sequence(5'-3')		 元件类型
Type of element		 数量
Amount
I box GATAA 光调节保守序列 5
ATCT-motif AATCTAATTC 光响应元件 2
G-box CACGTC 光响应元件 1
TCT-motif TCTTAC 光响应元件 1
Box 4 ATTAAT 光响应元件 1
CPBCSPOR TATTAG 细胞分裂素、叶绿素、叶绿体调控相关位点 4
TGACG-motif TGACG MeJA(茉莉酸甲酯)响应元件 5
ARFAT TGTCTC 生长素响应元件 1
ABRE ACGTG 脱落酸响应元件 1
MYB recognition site CCGTTG MYB转录因子识别位点 1
MYB binding site CAACAG MYB转录因子结合位点 3
CCAAT-box CAACGG MYBHv1结合位点 1
ARE AAACCA 厌氧诱导元件 2
ANAERO1 AAACAAA 厌氧诱导元件 2
LTR CCGAAA 低温响应元件 2

2.3 P39蛋白的同源进化分析

目前,有研究报道的P39蛋白仅拟南芥AtP39一种[13,5⇓⇓-8],本研究选择了水稻、玉米、大豆等13 种常见的单、双子叶农作物和经济作物,通过Blast搜索获得这些植物的P39同源蛋白序列(蛋白质登录号见图2)。采用DNAMAN进行序列比对,结果显示,13 种植物的P39蛋白均与AtP39蛋白具有较高的序列相似性(图3)。此外,AtP39蛋白含有一个高度保守的由27个氨基酸残基组成的L6 loop区,位于第245-271 氨基酸残基处,其功能可能是参与蛋白质构象转变的调节[3],参与比对的12种P39蛋白也均在相同位置存在L6 loop区,其中,水稻OsP39的L6 loop区与AtP39仅相差一个氨基酸残基(图3)。采用MEGA软件,选择最大可能性法[13],对P39蛋白进行序列比对和进化树构建,结果显示,水稻OsP39蛋白序列与高粱SbP39的遗传距离最近,为0.086 8(图2)。
图2 P39蛋白的系统进化树
At.拟南芥;Os.水稻;Sb.高粱;Zm.玉米;Ac.菠萝;Ao.芦笋;Bo.甘蓝;Gm.大豆;Nn.荷花;Nt.烟草;Sl.番茄;St.马铃薯;Vv.葡萄。图3同。

Fig.2 Phylogenetic tree of P39 proteins

At.Arabidopsis thalianan;Os.Oryza sativa;Sb.Sorghum bicolor;Zm.Zea mays;Ac.Ananas comosus;Ao.Asparagus officinalis;Bo.Brassica oleracea var.Oleracea;Gm.Glycine max;Nn.Nelumbo nucifera;Nt.Nicotiana tabacum;Sl.Solanum lycopersicum;St.Solanum tuberosum;Vv.Vitis vinifera.The same as Fig.3.

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图3 P39蛋白的序列比对

Fig.3 Sequence alignment of P39 proteins

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2.4 OsP39蛋白的理化性质

利用Expasy-ProtParam数据库进行蛋白质性质分析,结果显示,OsP39蛋白含361 个氨基酸残基,包含了全部20 种蛋白质氨基酸,其中甘氨酸含量最高,为44 个,占总数12.2%,其次为亮氨酸和丝氨酸,分别为33,32 个,色氨酸数量最少,为2 个,生理条件下带负电荷氨基酸(谷氨酸+天冬氨酸)总数29 个,带正电荷氨基酸(赖氨酸+精氨酸)总数33 个。蛋白质分子量38.7 ku,理论等电点pH值8.64,不稳定指数32.6,小于40,稳定性较好[14],脂肪指数83.71,热稳定性高,属于耐热型蛋白[15],平均疏水性-0.103,偏向亲水。

2.5 OsP39蛋白信号肽和跨膜螺旋区预测

通过SignalP进行信号肽分析,在OsP39蛋白中未识别到氨基端信号肽序列(图4),利用TMHMM数据库分析蛋白质的跨膜螺旋区,未预测到跨膜螺旋结构(图5)。
图4 OsP39蛋白的信号肽分析

Fig.4 Analysis of signal peptide of OsP39 protein

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图5 OsP39蛋白的跨膜螺旋区分析

Fig.5 Analysis of transmembrane helical region of OsP39 protein

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2.6 OsP39蛋白的空间结构

二级结构预测显示,OsP39蛋白的二级结构元件以无规卷曲和伸展肽链(β折叠片)为主,其中无规卷曲比例最高,占50.97%,其次为伸展肽链,占30.57%,α螺旋和β转角分别占12.74%,5.54%,不含310螺旋、π螺旋等元件(图6)。
图6 OsP39蛋白的二级结构元件

Fig.6 Secondary structure elements of OsP39 protein

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通过SWISS-MODEL数据库进行三级结构预测显示,OsP39的空间结构与拟南芥AtP39蛋白几乎相同,都为含多个β折叠片的β-桶状膜蛋白(图7),桶状结构主体部分插入膜内,L6 loop区形成松散的环状结构,位于通道入口处(图7)。
图7 OsP39蛋白的三级结构
黑色箭头指示L6 loop区。

Fig.7 Tertiary structure of OsP39 protein

Black arrows indicate the L6 loop region.

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2.7 OsP39蛋白的蛋白质互作和亚细胞定位预测

通过STRING数据库进行蛋白质互作分析显示,目前有证据支持的与OsP39蛋白(转录产物ID:OS05T0510200-01)存在互作关系的水稻基因有10 个(图8),其中可信度最高的是谷胱甘肽硫转移酶(OS06T0168000-01),其次为OsDVB1蛋白(OS03T0840900-01),该蛋白与植物发育有关,以及OS06T0111600-01(含有依赖AMP的合成酶/连接酶结构域的蛋白质),其他可能与OsP39存在互作关系的蛋白质分别为OsJ_04947(ABC转运蛋白亚基)、OS12T0422971-00(NADH脱氢酶亚基9类似蛋白)、OsJ_20876(果糖/塔格糖二磷酸醛缩酶)、OsJ_10671(类ISP42蛋白)、OsJ_05254(未知功能蛋白)、OS02T0496900-01(线粒体输入受体TOM9-2亚基)、OS01T0276200-00(线粒体输入受体亚基TOM40类似蛋白)。上述可能的互作蛋白在水稻中多数未被深入研究,其中的类ISP42蛋白、OS02T0496900-01等蛋白与线粒体蛋白质输入有关。通过PredictProtein数据库进行亚细胞定位预测则显示,OsP39蛋白定位于叶绿体膜(图9)。
图8 OsP39蛋白与其他水稻蛋白的互作关系预测
直线的粗细程度表示可信程度。

Fig.8 Prediction of interactions of OsP39 protein with other rice proteins

The thickness of the straight line indicates the degree of confidence.

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图9 OsP39蛋白的亚细胞定位预测

Fig.9 Prediction of subcellular localization of OsP39 protein

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2.8 OsP39蛋白的亚细胞定位

尽管通过SignalP未预测到信号肽序列,但空间结构预测结果显示,OsP39蛋白为膜蛋白,亚细胞定位预测也显示,该蛋白为叶绿体膜定位蛋白。为确定OsP39蛋白在水稻细胞内的定位情况,以绿色荧光蛋白GFP作为报告蛋白,使用酶切、连接法构建了Osp39编码序列与gfp序列融合的瞬时表达载体。用带有Osp39-gfp融合表达框的质粒转化原生质体后,发现OsP39-GFP融合蛋白主要出现在叶绿体区域,且GFP荧光与叶绿素自发荧光叠加后并未混合为黄光,因此,可以确定OsP39-GFP融合蛋白没有出现在叶绿体基质,而是定位在叶绿体膜(图10),表明OsP39是与水稻叶绿体膜功能相关的蛋白质。另外,少量OsP39-GFP融合蛋白积累在细胞质,推测为蛋白质表达过量导致。作为对照的gfp质粒转化原生质体后,GFP蛋白则全部定位于细胞质(图10)。
图10 OsP39-GFP融合蛋白和GFP在水稻原生质体中的定位

Fig.10 Subcellular localization of OsP39-GFP fusion protein and GFP in rice protoplasts

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2.9 Osp39基因的组织表达

为明确Osp39基因在水稻中的组织表达情况,采用定量PCR进行了基因在不同时期和不同组织中的转录水平分析。结果显示,在苗期,Osp39在水稻叶片中表达水平最高,其次为叶鞘,而在根中最低。在开花期,Osp39在水稻旗叶中表达水平最高,其次为茎,在花(包括雄蕊、雌蕊和颖壳)中表达量最低。在不同时期和不同组织中,Osp39基因的表达水平不同,但在叶和叶鞘等绿色组织中的表达水平极显著高于根和花等组织(图11)。
图11 Osp39基因在不同时期和组织中的表达水平
叶、叶鞘和根取自14 d水稻苗;旗叶、茎和花取自扬花期水稻。不同的大写字母表示差异的极显著性(P<0.01)。

Fig.11 Expression level of Osp39 gene in different stages and tissues

Leaves,leaf sheaths and roots were taken from 14-day rice seedlings;flag leaves,stems and flowers were taken from flowering rice.Different capital letters indicate extremely significant differences(P<0.01).

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3 结论与讨论

叶绿体中含有约3 000种蛋白质,其中绝大多数由核基因组编码,在细胞质中翻译后,输入到叶绿体[16]。拟南芥通过CHLORAD机制调节叶绿体等质体蛋白质的输入,AtP39蛋白是该机制中的一个重要作用因子,参与泛肽化蛋白由叶绿体外膜转运回细胞质的过程[1]。本研究采用生物信息学手段及转录分析、瞬时表达等方法,确定了水稻Osp39基因的序列特征、组织表达情况以及OsP39蛋白的性质、结构和亚细胞定位情况,确定OsP39与拟南芥AtP39蛋白具有高度相似性。
由于目前尚未在β-桶状膜蛋白中发现规律性的信号肽序列[17-18],因此,本研究利用SignalP数据库对OsP39蛋白进行信号肽分析时,未能预测到信号肽序列。Gross等[19]研究表明,β-桶状膜蛋白的定位信息存在于蛋白质N端的6个β-折叠片中,定位过程还涉及叶绿体外膜TOC蛋白等蛋白质的参与,其详细定位机制尚不清楚。但此类蛋白确实可以进行正确的膜定位,拟南芥AtP39蛋白的叶绿体膜定位[3],以及本研究中OsP39蛋白的亚细胞定位结果,均反映了这一事实,也证实了OsP39是一种在叶绿体膜上发挥功能的蛋白质,与Osp39基因的启动子上游元件分析结果和组织表达结果相符合。
Osp39基因启动子中含有多个光响应、叶绿体调节和激素响应顺式作用元件,组织表达分析也显示,Osp39基因的表达具有明显的组织特异性,在苗期和开花期,其在叶中均具有最高表达水平,而在非绿色组织根和花中的表达水平最低,这种表达模式与P39蛋白参与叶绿体调节的功能相对应。在拟南芥中已经确定AtP39蛋白与SP1蛋白和CDC48蛋白均具有互作关系[1],但由于水稻OsP39蛋白和OsSP1蛋白的研究报道较少,缺乏文献等支持,因此,在蛋白质互作预测中未能预测到OsP39与水稻OsSP1蛋白和OsCDC48蛋白的互作关系。本研究的组织表达结果显示,Osp39基因在叶片、叶鞘和根中的表达水平和变化趋势均与水稻OsSP1基因接近[9],并且OsSP1蛋白也定位于叶绿体[9],反映了二者在功能上的关联性。
本研究在前期工作中发现,水稻的OsSP1基因编辑植株具有严重的生长发育障碍,且结实率极低[10],Huang等[20-21]的研究显示,Oscdc48基因突变后水稻也出现早衰、叶片黄化、褐斑、结实率下降、早亡等表型,表明参与CHLORAD机制的基因对水稻的生长发育具有重要调控作用,Osp39基因在水稻生长发育、胁迫响应过程中的作用有待于进一步研究,本研究分析结果为Osp39基因功能的深入研究提供了基础,也为水稻叶绿体蛋白的输入调控研究提供了新的线索。

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江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ211619)

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