兰州鲇Dmrta1基因克隆及其组织时空表达规律

柳婷, 李敏敏, 赖章龙, 刘彦斌, 刘凯, 肖伟, 赛清云, 田永华, 杨立强, 阮超岭, 杨瑞兰, 刘哲, 连总强

华北农学报. 2023, 38(6): 228-238

华北农学报 ›› 2023, Vol. 38 ›› Issue (6) : 228-238. DOI: 10.7668/hbnxb.20193954
畜牧·水产·兽医

兰州鲇Dmrta1基因克隆及其组织时空表达规律

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Cloning of Dmrta1 Gene and Its Temporal and Spatial Expression in Tissue of Silurus lanzhouensis

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摘要

为了解Dmrta1基因的生物学特性及其在兰州鲇生长发育中的生理作用,以及为加快实现全雄兰州鲇群体生产提供理论依据和技术支撑。采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得兰州鲇Dmrta1全长cDNA序列,通过qRT-PCR技术检测该基因在兰州鲇胚胎发育、仔稚幼鱼以及3龄雌雄异体和3龄雌雄同体不同组织中的表达特征。结果表明,兰州鲇Dmrta1基因cDNA全长1 415 bp,ORF全长1 158 bp,共编码385个氨基酸,包含20种氨基酸;经SMART预测显示,该基因属于典型的Dmrta亚家族蛋白,具有保守的DM和DMA结构域。同源性比对和系统进化树分析结果表明,兰州鲇与南方鲇的相似性最高(95.47%),且亲缘关系最近。组织表达结果表明,Dmrta1 mRNA在未受精卵粒及胚胎发育各个时期均有表达,而在未受精卵粒中表达最高(P<0.05);在兰州鲇孵化后40 d内不同发育时期中,Dmrta1 mRNA在同期XX个体组织中表达均显著高于XY个体,且在35 d迅速达到峰值(P<0.05);Dmrta1 mRNA在3龄雌雄异体兰州鲇雌性卵巢、鳃和雄性鳃组织中表达显著高于其他组织(P<0.05),且卵巢表达显著高于雌性和雄性鳃,除卵巢表达是精巢的47.07倍外,其他组织中不存在雌雄性别差异;3龄雌雄同体和3龄雌雄异体表达特征一致,都是卵巢表达显著高于鳃和精巢(P<0.05)。以上结果说明,Dmrta1基因属于母源基因,该基因可能在兰州鲇性别分化、卵子形成和鳃弓形成过程中发挥重要作用,在雌雄同体和雌雄异体兰州鲇性腺中的作用一致。

Abstract

In order to understand the biological characteristics of Dmrta1 gene and its physiological role in the growth and development of Silurus lanzhouensis,and to provide theoretical basis and technical support for the realization of full male S.lanzhouensis population production.Homologous cloning and cDNA terminal rapid cloning(RACE)techniques were used to obtain the full-length cDNA sequence of S.lanzhouensis Dmrta1.qRT-PCR was used to detect the expression characteristics of this gene in different tissues of S.lanzhouensis such as embryo development,larvae and juveniles,third instar hermaphroditic and third instar hermaphroditic.The results showed that the cDNA length of Dmrta1 gene was 1 415 bp and that of ORF was 1 158 bp,encoding 385 amino acids.SMART prediction showed that the gene belonged to a typical Dmrta subfamily protein with conserved DM and DMA domains.The sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that S.lanzhouensis and S.meridionalis had the highest similarity(95.47%) and were closely related.The results of tissue expression showed that Dmrta1 mRNA was expressed in all stages of unfertilized and embryonic development,and the highest expression was in unfertilized egg(P<0.05).In different developmental stages of S.lanzhouensis within 40 days after incubation,the expression of Dmrta1 mRNA in XX individuals was significantly higher than that in XY individuals,and rapidly reached the peak value on 35 days(P<0.05).The expression of Dmrta1 mRNA in the ovary and gills of female catfish of the third age was significantly higher than that in other tissues(P<0.05),and the expression in the ovary was significantly higher than that in the gills of male and female catfish.Except that the expression in the ovary was 47.07 times that in the sperms,there was no difference between male and female in other tissues.The expression characteristics of the third instar hermaphrodite and the third instar hermaphrodite were the same,and the egg expression was significantly higher than that of the gill and germ nest(P<0.05).These results indicated that Dmrta1 gene had parental genetic characteristics and belongs to the mother gene.This gene may play an important role in the process of sex differentiation,ovum formation and gill arch formation of S.lanzhouensis,and it has the same role in the gonads of both hermaphroditic and hermaphroditic S.lanzhouensis.

关键词

兰州鲇 / Dmrta1基因 / 基因克隆 / 早期生活史 / 雌雄同体 / mRNA表达

Key words

S.lanzhouensis / Dmrta1 gene / Gene cloning / Early life stages / Hermaphroditism / mRNA expression

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柳婷 , 李敏敏 , 赖章龙 , 刘彦斌 , 刘凯 , 肖伟 , 赛清云 , 田永华 , 杨立强 , 阮超岭 , 杨瑞兰 , 刘哲 , 连总强. 兰州鲇Dmrta1基因克隆及其组织时空表达规律. 华北农学报. 2023, 38(6): 228-238 https://doi.org/10.7668/hbnxb.20193954
Ting LIU , Minmin LI , Zhanglong LAI , Yanbin LIU , Kai LIU , Wei XIAO , Qingyun SAI , Yonghua TIAN , Liqiang YANG , Chaoling RUAN , Ruilan YANG , Zhe LIU , Zongqiang LIAN. Cloning of Dmrta1 Gene and Its Temporal and Spatial Expression in Tissue of Silurus lanzhouensis. Acta Agriculturae Boreali-Sinica. 2023, 38(6): 228-238 https://doi.org/10.7668/hbnxb.20193954
兰州鲇(Silurus lanzhouensis)又称黄河鲶,隶属于鲇形目(Siluriformes)鲇科(Siluridea)鲇属(Silurus),主要分布在我国黄河中上游区域的甘肃、宁夏和内蒙古等地区,是我国黄河中上游流域特有的大型肉食性经济鱼类,因其具有刺少味美、产肉率高、肉质细嫩、蛋白质丰富等特点,素有“黄河鲶鱼活人参”之称[1-2],已成为我国重要的商品鱼,市场需求随之增长,其性成熟需要3 a,成熟的同龄雄鱼个体比雌鱼个体大1.5倍,雌雄混养雄鱼会蚕食雌鱼,且生长速度和体型具有明显的性别二态性[3]。目前,关于兰州鲇的研究主要集中在种质繁育[4-5]、微卫星标记[6-7]和饲料营养[8-9]等,而在兰州鲇性别控制方面研究较少。有研究发现,兰州鲇的性别决定系统是XX/XY雄性异配,且在生产过程中偶然发现了XY基因型的雌雄同体兰州鲇,对其利用两性性腺的卵子和精子进行自体精卵人工授精,成功获得YY雄性后代,并获得了性别特异标记[10]。但在幼体甚至成体阶段,利用形态特征很难区分雌性和雄性,因此开展全雄兰州鲇养殖,可以显著提高其整体速度和规格整齐度。
DMRT(Doble-sex and Mab-3 Relatated Transcription factor)基因是指与果蝇(Drosophila melanogaste)的性别决定基因Doublesex(Dsx)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的性别决定基因Maleabnormal-3(Mab-3)同源的基因[11-12]。该基因家族主要特征是所编码的蛋白质都包含一个高度保守的DM结构域与特定的DNA序列相结合,从而调控下游基因[13]。其中Dmrt3(Dmrta3)、Dmrt4(Dmrta1)、Dmrt5(Dmrta2)3个成员组成Dmrta亚家族,其特征是存在一个额外高度保守的DMA结构域[14]。Dmrta1是一个广泛参与性腺发育、神经发育和器官形成的基因,在小家鼠(Mus musculus)的性腺、肾脏和脑[15],奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)的性腺、脑和垂体[16],团头鲂(Megalobrama amblycephala)的性腺、鳃和肾脏[17],青鱂(Oryzias latipes)的性腺、眼和嗅觉系统[18],非洲爪蟾(Xenopus laevis)的神经和嗅觉系统[19]发育中均有表达。其中奥利亚罗非鱼仅在成鱼卵巢中表达[16],在团头鲂卵巢中的表达量高于精巢[17],但在青鱂精巢中表达量高于卵巢[18]。目前,关于兰州鲇的性别决定机制尚未阐明,有关兰州鲇性别相关基因研究较少,而性别决定和性腺分化是鱼类生长和繁殖中的重要过程,因此,本研究以兰州鲇为研究对象,从性别决定与分化相关基因入手,选择Dmrta1基因对其进行cDNA序列全长克隆和生物信息学分析,应用qRT-PCR技术分析了该基因在兰州鲇胚胎发育、仔稚幼鱼、3龄雌雄异体和3龄雌雄同体不同组织中的表达情况,从而探讨其在兰州鲇生长发育、性别分化和性别形成过程中的作用,以期为培育全雄兰州鲇养殖新对象提供理论基础和数据支撑。

1 材料和方法

1.1 试验用鱼及样品采集

本试验所用的3龄雌雄兰州鲇来源于宁夏回族自治区水产研究所国家级兰州鲇原种场建设基地,全长为(52.65±2.88)cm,体质量为(715.35±82.80)g。用MS222麻醉后快速解剖采集心脏、肝、脾、肌肉、肾、鳃、脑、下丘脑、垂体、卵巢和精巢等组织,迅速投入液氮中冷冻,然后放入-80 ℃超低温冰箱中保存供后续提取RNA。
2022年的兰州鲇繁殖和苗种培育季节,在宁夏回族自治区水产研究所国家级兰州鲇原种场建设基地采集胚胎发育样品和仔稚幼鱼样品。选择3龄以上健康兰州鲇亲鱼,进行人工繁殖,孵化期水温为21.5~23.0 ℃。之后根据兰州鲇胚胎发育时期阶段的划分[4,20],在倒置显微镜下观察,每次取10个以上的卵粒观察,记录胚胎发育时序,采集未受精、胚盘期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期、出膜期8个时期的样本,液氮速冻后,放在-80 ℃冰箱保存。将出膜后的兰州鲇放入300 L圆形循环水桶中养殖,出膜第3天开始投喂丰年虫,第30 天后投喂冰鲜丰年虫成虫。试验期间饱食投喂,水中不断曝气,2 d换一次水,换水量为养殖水体的1/5,水温为22~25 ℃。出膜后从第10 天开始每隔5 d取一次样,每次样品剪掉头和尾保留腹部,放入液氮速冻,转至-80 ℃保存备用,尾部保存在无水乙醇中,-20 ℃冰箱保存,用于遗传性别鉴定。

1.2 试验主要试剂和引物

DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和RNA提取试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司;2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)购自南京诺唯赞生物科技有限公司;大肠杆菌(Escherichia coli)Trans5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;荧光定量PCR试剂TB Green Premix ExTaqⅡ、反转录试剂Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、pMD18-T克隆载体和SMARTer® RACE 5'/3'Kit等试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。克隆和荧光定量PCR引物以及性别鉴定引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 总RNA提取和cDNA合成

取兰州鲇成鱼不同组织、胚胎和仔稚幼鱼样品各约10~20 mg,放入1.5 mL离心管后,根据总RNA试剂盒(天根)说明书提取RNA。提取的总RNA通过微量分光光度计(ALLSHFNG,中国)检测浓度和OD260/280(值为1.8~2.0),总RNA的完整性利用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,最后置于-80 ℃冰箱保存。选取检测合格的RNA,根据PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大连)试剂盒说明书将其反转录生成cDNA第1链;使用SMARTer® RACE 5'/3'Kit(TaKaRa,大连)反转录试剂盒,以兰州鲇卵巢RNA为模板,根据操作手册分别合成5'-RACE Ready cDNA和3'-RACE Ready cDNA第1链,-20 ℃保存,为后续用于Dmrta1基因中间序列克隆、组织表达分析和 5'/3'末端序列克隆做准备。

1.4 兰州鲇Dmrta1基因cDNA全长克隆

根据NCBI中同源物种南方鲇的Dmrta1基因序列(GenBank登录号:XM_046842691.1),利用Primer Premier 5.0软件设计引物Dmrta1-F和Dmrta1-R(表1),以上述步骤中合成的3龄兰州鲇卵巢第1链cDNA为模板,进行Dmrta1基因核心片段的PCR克隆。Dmrta1基因RT-PCR反应参数为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共计33个循环,最后72 ℃延伸8 min。扩增体系为25 μL,包括12.5 μL 的2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)、2.5 μL 的cDNA样品、1.0 μL的正向引物(10 μmol/L)、1.0 μL的反向引物(10 μmol/L)和8 μL的无菌ddH2O。运用Oligo 7.0软件根据已获得的Dmrta1核心片段设计RACE引物(表1),以合成的卵巢5' RACE Ready cDNA和3' RACE Ready cDNA为模板,参照SMARTer® RACE 5'/3' Kit说明书和上述引物进行5' cDNA和3' cDNA末端克隆。降落PCR结束后,将PCR产物稀释10倍为模板,进行巢式PCR扩增。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA的回收与纯化,随后将得到的DNA片段与pMD18-T载体(TaKaRa,大连)连接,再转化到Trans5α感受态细胞中,37 ℃振荡培养60 min,在含有氨苄抗生素的LB固体培养基上均匀涂开,37 ℃倒置过夜培养,最后挑选单个菌落进行菌液PCR验证后,筛选出阳性菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,最后通过拼接得到兰州鲇Dmrta1基因的cDNA全长。
表1 本研究所用引物序列

Tab.1 Primer sequences were used in this study

引物名称
Primer name		 引物序列(5'—3')
Primer sequence(5'—3')		 用途
Usage
Dmrta1-F GTCTCCAGTGGCAAAGAT 中间序列克隆
Dmrta1-R TCCAAGTTGAGGGTTTATT
Dmrta1-qF ACCTCAAAGTCTGCCTTCTCCCCA 荧光定量PCR
Dmrta1-qR CAGGTACGGAGAGATAAAACTCGG
β-actin-F AAGATCATTGCCCCACCTGA
β-actin-R CCTGCTTGCTGATCCACATC
Dmrta1-5gsp1 CCCTCTTTAGAAGTGAGCAGCAG 5'RACE-PCR
Dmrta1-5gsp2 CAGCTCGATGGTCTTTACAATGTC
Dmrta1-3gsp1 CTTTAGGAAATGATGGCTTCTACAG 3'RACE-PCR
Dmrta1-3gsp2 GCGTGTTGCTTATTCCGGTTC
UPM CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT RACE通用引物
UPM short primer CTAATACGACTCACTATAGGGC
Y-F AACCAGGTTTGAAATGAAAAGAG 性别鉴定
Y-R TGATTGCATACATTGGAGATAGA
X-F CATTGAAACGTGCAATGATACG
X-R CCATCAACTGTTATACTCTCATATTC
XY-F CTGCGTCTGCTCTGTCCAGCTACT
XY-R TCTGCACTGCATTCATGAATGCTG

1.5 DNA提取和遗传性别鉴定

取20 mg尾鳍组织,剪碎置于1.5 mL离心管。根据天根生物科技有限公司TIANamp血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA,DNA样本保存于-20 ℃。将提取的DNA使用微量分光光度计(ALLSHFNG,中国)检测其浓度,之后利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量,选用质量合格的DNA,应用文献报道[19]的兰州鲇3对性别决定特异性标记引物进行遗传性别鉴定,Y特异引物对雄性产生1条电泳条带,而对雌性不产生;X特异引物对雌性和雄性产生1条不同亮度的电泳条带,雌性电泳条带比雄性亮;X和Y共享特异引物,在所有雄性中产生2条电泳条带,所有雌性只产生1条,特异性引物序列见表1。

1.6 生物信息学分析

经过DNAMAN 6.0软件对Dmrta1基因全长cDNA序列进行拼接,之后应用NCBI在线Blast和OFR Finder进行拼接序列比对和预测开放阅读框,并翻译成氨基酸。通过在线软件分析Dmrta1蛋白基本理化性质、亲疏水性、跨膜区、信号肽、二级结构、亚细胞定位、结构域和氨基酸序列比对,具体软件和网址见表2。采用MEGA 11.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树。在基于兰州鲇全基因组数据分析库中获得Dmrta1基因的上、下游基因序列的基础上,依据NCBI和Ensembl数据库中获得有关人、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)和大西洋鳕(Gadus morhua)Dmrta1的上、下游基因,进行兰州鲇Dmrta1及其临近基因共线性分析。
表2 生物信息学分析软件

Tab.2 Bioinformatics analysis software

软件名称
Software name		 网址
Website		 用途
Function
ORF Finder https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ 开放阅读框分析
BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 同源性比对分析
ProtParam https://web.expasy.org/prot-param/ 蛋白质理化性质分析
ProtScale https://web.Expasy.org/protscale/ 蛋白质亲疏水性分析
SignalP 4.1 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/ 蛋白质信号肽分析
TMHMM http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 蛋白质跨膜结构预测
SMART http://smart.emblheidelberg.de/ 蛋白质结构域预测
PSORT http://psort.hgc.jp/form2.html 蛋白亚细胞定位预测
SOPMA https://npsa-prabi.ibcp.fr/ 蛋白质二级结构预测
Clustal Omega http://www.ebi. ac.uk/Tools/msa/clustalo/ 氨基酸序列比对

1.7 定量表达分析

依据获得的兰州鲇Dmrta1基因序列结果,利用Primer Premier 5.0软件设计Dmrta1基因qRT-PCR特异性引物Dmrta1-qF和Dmrta1-qR(表1),将上述兰州鲇不同组织、胚胎和仔稚幼鱼反转录合成的cDNA稀释为50 ng/μL。以β-actin为内参基因,稀释的cDNA为模板,使用Qtower 2.2定量PCR仪(德国耶拿)进行定量分析。qRT-PCR反应体系为20 μL:具体为10 μL TB Green Premix ExTaq Ⅱ、6.4 μL ddH2O、2 μL cDNA模板、0.8 μL正向引物(10 μmol/L)和0.8 μL反向引物(10 μmol/L)。实时荧光定量PCR反应程序设置为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,进行40个循环。所得数据采用2-ΔΔCt法计算Dmrta1基因在兰州鲇各组织中的相对表达量,数据用“平均值±标准差(Mean±s)”表示,之后用SPSS 25.0软件中的单因素方差分析对组织表达量进行显著性分析,当P<0.05时为差异显著,P>0.05时差异不显著,并用GraphPad Prism 8.0软件绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 Dmrta1基因cDNA全长及氨基酸序列分析

兰州鲇Dmrta1基因的cDNA全长为1 415 bp,包含15 bp的5'非编码区(Untranslated region,UTR)和242 bp的3'非编码区以及1 158 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),含1个ATG启动子和1个TGA终止子,共编码385个氨基酸,包含20种氨基酸,其中丝氨酸(Ser)最多占11.2%,色氨酸(Trp)最少占0.3%。运用SMART对该基因的功能结构域进行预测分析,结果显示,兰州鲇Dmrta1基因含有Dmrt家族特有的DM保守结构域和Dmrta亚家族独有的DMA结构域,分别位于28~81位和219~255位。Proparm分析显示,Dmrta1蛋白分子式为C1827H2922N526O559S19,理论等电点为8.84;蛋白分子量为41.81 ku,有45个带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)和38个带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu);不稳定指数为57.02,属不稳定蛋白;总亲水性平均值为-0.384,属亲水性蛋白。通过TMHMM 2.0 Server预测结果显示,该蛋白质无跨膜区域。用ProtScale分析显示,位于第60位的赖氨酸疏水性最强(疏水系数为1.922),位于第123位的赖氨酸亲水性最强(亲水系数为-2.933)。通过SignaIP 4.1对蛋白质信号肽分析,发现该蛋白不存在信号肽。PSORT亚细胞定位结果表明,Dmrta1蛋白位于细胞核、细胞质、线粒体和细胞骨架的概率分别为52.2%,30.4%,8.7%和8.7%。SOPMA在线预测Dmrta1蛋白存在4种二级结构,其中α-螺旋97个(25.19%)、延伸20个(5.19%)、β-折叠12个(3.12%)和无规则卷曲256个(66.49%)(图1)。
图1 兰州鲇Dmrta1蛋白二级结构预测
紫色.无规则卷曲;蓝色.α-螺旋;绿色.β-折叠;红色.延伸。

Fig.1 The predicted secondary structure of Dmrta1 protein in S.lanzhouensis

Purple.Random coil;Blue.Alpha-Helix;Green.Beta-Sheet;Red.Extended strand.

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2.2 Dmrta1基因共线性分析

对Dmrta1基因进行共线性分析表明,兰州鲇Dmrta1位于28号染色体,人类Dmrta1基因位于9号染色体(图2)。人和兰州鲇Dmrta1具有共线性的基因7个,但临近基因mpdz和elavl2排列顺序不同。Dmrta1在大西洋鳕和斑点叉尾鮰中分别位于17,29号染色体(图3),大西洋鳕和兰州鲇具有6个共线性基因,并且共线性基因顺序均不同,而斑点叉尾鮰与兰州鲇的上下游基因表现出高度的一致性。以上结果说明,不同物种在进化过程中存在染色体基因的扩张或丢失现象。
图2 兰州鲇和人Dmrta1基因共线性

Fig.2 Syntenic analysis for Dmrta1 genes in S.lanzhouensis and H.sapiens

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图3 兰州鲇和其他硬骨鱼类Dmrta1基因共线性

Fig.3 Syntenic analysis for Dmrta1 genes in S.lanzhouensis and other teleost species

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2.3 Dmrta1氨基酸序列比对与系统进化分析

通过NCBI上BlastP,对兰州鲇和其他物种(哺乳类、爬行类、两栖类、硬骨鱼类)Dmrta1氨基酸序列比对,结果显示(表3),兰州鲇与南方鲇(S.meridionalis)的相似性最高为95.47%,斑点叉尾鮰次之为85.40%,而与中华鳖(Pelodiscus sinensis)的相似性最远为36.02%。多重序列比对分析显示,兰州鲇与其他脊椎动物的Dmrta1含有保守的DM和DMA结构域(图4)。根据MEGA 11.0软件构建的系统进化树显示(图5),兰州鲇与其他硬骨鱼类的Dmrta1单独聚为一支,两栖类、哺乳类和爬行类的Dmrta1各自聚为一支。兰州鲇Dmrta1与南方鲇亲缘关系最近,与虹鳟的亲缘关系最远,与两栖类、哺乳类和爬行类的亲缘关系相对更远。
表3 兰州鲇Dmrta1氨基酸序列与其他物种同源性比对

Tab.3 Sequence alignment of Dmrta1 amino acid sequence in other species and S.lanzhouensis

物种
Species		 基因登录号
GenBank No.		 相似性/%
Similarity
斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus XP_017316285.1 85.40
虎头鲨Pangasianodon hypophthalmus XP_026800957.1 84.25
黄颡鱼Tachysurus fulvidraco XP_027013753.1 80.11
南方鲇Silurus meridionalis XP_046698647.1 95.47
大西洋鳕Gadus morhua XP_030194020.1 43.34
大黄鱼Larimichthys crocea XP_010735509.1 48.04
白斑狗鱼Esox lucius XP_010886381.2 49.87
褐鳟Salmo trutta XP_029615604.1 51.57
虹鳟Oncorhynchus mykiss XP_021433981.1 50.52
金钱鱼Scatophagus argus AYN77807.1 47.81
团头鲂Megalobrama amblycephala AHB63700.1 47.91
西方爪蟾Xenopus tropicalis NP_001072447.1 44.80
人类Homo sapiens NP_071443.2 41.36
绵羊Ovis aries XP_004004458.3 43.06
中华鳖Pelodiscus sinensis XP_025043468.1 36.02
图4 不同物种Dmrta1氨基酸部分序列比对分析

Fig.4 Sequence alignment of Dmrta1 amino acid sequences in different species

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图5 不同物种Dmrta1氨基酸序列系统进化树

Fig.5 Phylogenetic tree of Dmrta1 amino acid sequences of different species

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2.4 兰州鲇Dmrta1 mRNA在胚胎发育中的表达分析

为研究Dmrta1基因在兰州鲇胚胎发育过程中的表达调控作用,采用qRT-PCR技术对未受精卵及受精后胚胎不同发育时期的Dmrta1表达情况进行了验证分析。结果表明,在未受精卵及胚胎发育各个时期都可检测到Dmrta1的表达,且在未受精卵粒中Dmrta1的表达最高,在卵裂期之前均具有较高的表达水平,之后Dmrta1表达量随发育期的延续呈显著下降趋势(图6)。上述结果表明,该基因在兰州鲇中属于母源基因。
图6 兰州鲇胚胎发育过程中Dmrta1 mRNA表达特性
1.未受精;2.胚盘;3.卵裂;4.囊胚期;5.原肠;6.神经胚;7.器官形成期;8.出膜。内参基因.β-actin。不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05)。图8—11同。

Fig.6 The temporal expression pattern of Dmrta1 mRNA during embryonic development of S.lanzhouensis

1.Unfertilized;2.Blastodisc;3.Cleavage;4.Blastula;5.Gastrula;6.Neurula;7.Organogenetic period;8.Hatching.Internal reference gene.β-actin.Different letters indicated significant differences(P<0.05),while the same letter indicated no significant difference(P>0.05).The same as Fig.8—11.

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2.5 兰州鲇Dmrta1 mRNA在仔稚幼鱼生长发育过程中的表达情况

为研究Dmrta1基因分别在XX和XY仔稚幼鱼生长发育过程中的表达调控作用,应用3对性别决定标记引物进行尚未性别分化仔稚幼鱼雌雄遗传鉴定,结果见图7。采用qRT-PCR技术对兰州鲇孵化后40 d内不同发育期表达情况进行分析,由图8可见,试验期内Dmrta1在同期XX个体组织中的表达量均高于XY个体,其中XX仔稚幼鱼在孵化后10~30 d期间表现出随日龄增长显著降低的特征,而在35 d时迅速达到峰值,其后又呈现出逐步下降趋势;Dmrta1在孵化后40 d内XY个体组织中的表达量均呈现出随日龄增长而下降的变化规律。
图7 兰州鲇遗传性别鉴定

Fig.7 Identification of genetic sex of S.lanzhouensis

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图8 兰州鲇仔稚幼鱼生长发育过程中Dmrta1 mRNA表达水平变化

Fig.8 Temporal expression pattern of Dmrta1 mRNA in larvae and juveniles of S.lanzhouensis

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2.6 兰州鲇Dmrta1 mRNA在正常雌雄异体不同组织中的表达分析

为研究Dmrta1基因在兰州鲇性别维持和调控中的作用,以3龄正常性成熟兰州鲇雌雄个体为研究对象,分别对其肝脏、脾脏、鳃、肌肉、肾、心脏、脑、下丘脑、垂体、性腺等10种组织中Dmrta1表达情况进行分析。由图9可见,雌性个体的性腺(卵巢)、鳃和雄性鳃组织中Dmrta1的表达显著高于其他组织,且卵巢组织中的表达量显著高于雌性和雄性鳃组织。除卵巢组织中Dmrta1表达量是精巢的47.07倍外,其他组织中不存在雌雄性别差异。以上结果表明,Dmrta1基因在兰州鲇性成熟个体的组织表达中具有明显的组织特异性和性别二态性。
图9 3龄雌雄异体兰州鲇不同组织中Dmrta1基因表达

Fig.9 Expression of Dmrta1 gene in different tissues of 3-year-old male and female of S.lanzhouensis

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2.7 兰州鲇Dmrta1 mRNA在雌雄同体不同组织的表达分析

为研究Dmrta1基因在3龄雌雄同体兰州鲇不同组织中的表达情况,本研究利用qRT-PCR技术检测Dmrta1 mRNA在3龄兰州鲇雌雄同体肝脏、脾脏、鳃、肌肉、肾、心脏、脑、下丘脑、垂体、卵巢和精巢11个组织中的表达变化。由图10可见,Dmrta1 mRNA在3龄兰州鲇雌雄同体的卵巢、鳃和精巢组织中表达显著高于其他组织,且卵巢表达显著高于鳃和精巢,其他组织间的表达差异不显著。Dmrta1 mRNA在3龄雌雄同体兰州鲇和雌雄异体兰州鲇性腺组织中表达结果显示(图11),Dmrta1 mRNA在雌雄同体和正常雌鱼卵巢中的表达量远高于雌雄同体和正常雄鱼精巢表达,且雌鱼卵巢表达显著高于雌雄同体卵巢表达;而精巢表达在雌雄同体和雄鱼两者中表达差异不显著。
图10 3龄雌雄同体兰州鲇不同组织中Dmrta1基因表达

Fig.10 Expression of Dmrta1 gene in different tissues of 3-year-old hermaphroditic S.lanzhouensis

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图11 3龄雌雄同体和雌雄异体兰州鲇性腺中Dmrta1基因表达

Fig.11 Expression of Dmrta1 gene in the gonads of 3-year-old hermaphroditic and dioecious S.lanzhouensis

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3 结论与讨论

Dmrta1基因对性腺发育、器官形成和神经发育具有重要作用。Dmrta1基因是Dmrta基因亚家族中的一员,该亚家族成员共同特征是都含有1个DM和DMA结构域,而DM结构域能与特定的DNA序列相结合以调控下游基因的表达,进而控制性别的分化及早期发育[13-14]。通过SMART预测,兰州鲇具有DM和DMA结构域,符合Dmrta基因亚家族结构特征,该结果与金钱鱼(S.argus)Dmrt4和白斑狗鱼(E.lucius)Dmrta1一致,而在团头鲂中研究发现存在Dmrt4的2种剪接形式,分别是Dmrt4a和Dmrt4b,其中Dmrt4a含有DM和DMA 2个结构域,但Dmrt4b仅含有DMA 1个结构域[17,21-22]。氨基酸同源性比对结果显示,兰州鲇与南方鲇Dmrta1氨基酸序列的同源性最高,与斑点叉尾鮰、虎头鲨、黄颡鱼具有较高的同源性,与其他两栖类、哺乳类、爬行类的同源性较低。系统进化树显示,兰州鲇Dmrta1与南方鲇聚为一小支,亲缘关系最近,符合物种进化关系越近,氨基酸序列保守性高的规律。
本研究通过qRT-PCR技术检测了Dmrta1 mRNA在兰州鲇胚胎发育、雌雄仔稚幼鱼、3龄雌雄异体和雌雄同体不同组织中的表达情况。胚胎发育中的表达结果显示,在兰州鲇未受精卵粒中检测到较高的Dmrta1 mRNA表达,这与大西洋鳕 [23]中Dmrt4 mRNA和栉孔扇贝(Chlamys farreri)[24]中Cf-dmrt4-like在未受精的卵子中检测到的结果一致,表明该基因属于母源基因。另外,在兰州鲇胚胎发育各阶段均可检测到Dmrta1 mRNA的表达,但在胚胎孵化出膜期只有微弱表达,该结果与金钱鱼 [21]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[25]中Dmrt4 mRNA在胚胎发育过程中的表达模式相似。而青鱂在胚胎发育过程中没有检测到,直到幼鱼期才开始表达[18],非洲爪蟾胚胎发育过程中,Dmrt4最初在前神经脊表达,然后逐渐局限于部分端脑和嗅觉胎盘上皮细胞[19]。在兰州鲇仔稚幼鱼生长发育阶段,Dmrta1在同期XX个体表达均显著比XY个体表达高,而在35 d时XX个体迅速达到峰值。团头鲂中Dmrta1在出膜后1 d高表达,30 d表达量最高[17]。奥利亚罗非鱼Dmrta1在孵化后1 d一直维持在较高水平,15,30 d后,经17β-雌二醇处理的Dmrt4基因表达水平显著升高[16]。张修月等[26]发现雌性南方鲇在35 d时卵巢中可见成团发育的卵原细胞,兰州鲇分子育种技术建立与应用课题组在《超雄兰州鲇培育中精子冻存、性别诱导转化及生长功能基因初步研究》中研究发现,雌性兰州鲇在34 d时卵巢中存在大量卵原细胞,因此推测,Dmrta1基因在35 d XX兰州鲇个体中的高表达可能与卵巢分化有关,表明了Dmrta1基因在兰州鲇卵巢分化中发挥重要作用,并且该基因在不同物种中的不同时期表达有所不同。
组织表达结果显示,Dmrta1基因在所检测的雌雄异体3龄兰州鲇各组织中有性别二态性差异,并且在不同组织中表达量存在显著差异,说明Dmrta1基因可能在不同组织中发挥着不同的作用。Dmrta1基因在兰州鲇卵巢表达量显著高于精巢,这与团头鲂、大西洋鳕和史氏鲟(Acipenser schrenckii)的Dmrta1在成体卵巢的表达量高于精巢的表达方式相似[17,23,27];而在雌性兰州鲇卵巢中表达最高,其次是鳃、脑和下丘脑,雄性兰州鲇在鳃组织中显著高表达,其次是精巢、肾和下丘脑。而奥利亚罗非鱼的Dmrt4 mRNA仅在成体卵巢中检测到[16];相反,在青鱂、牙鲆(Paralichthys olivaceus)的Dmrt4基因在成体精巢的表达高于卵巢[18,28]。与其他物种Dmrta1基因表达相比之后,发现物种间不同组织中、雌雄个体之间表达并不完全一致。兰州鲇的Dmrta1在性腺和鳃中高表达,奥利亚罗非鱼的Dmrt4在垂体和脑中表达,且雌性表达高于雄性[16],青鳉的Dmrt4在成体脑、嗅觉系统中表达[18],日本红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的Dmrt4基因在成体性腺和脾中表达[29]。在不同物种的相同组织中具有不同的表达模式,这说明Dmrta1基因是多功能基因,可能在成体组织的功能维持方面发挥作用,并且在呼吸器官、神经系统、嗅觉系统和免疫系统形成中发挥作用。
通过qRT-PCR技术检测兰州鲇雌雄同体不同组织中的Dmrta1基因表达情况以及雌雄同体和雌雄异体性腺中Dmrta1基因表达对比分析,结果表明兰州鲇雌雄同体和雌雄异体表达模式一致,两者主要在性腺和鳃中表达,且卵巢中的表达远远高于精巢和鳃,而Dmrta1基因在兰州鲇雌雄异体雌鱼卵巢中表达比雌雄同体卵巢表达高,两者精巢表达差异不显著。雌雄同体是一种在单个个体中同时表现出雄性生殖细胞和雌性生殖细胞的一种特殊现象[30],这种现象在软骨鱼类中尚未发现,在硬骨鱼类中存在,其可分为同时型和顺序型雌雄同体。花斑溪鏘(Kyptolebias marmoratus)是同时型雌雄同体并可自体受精[31]。顺序型雌雄同体有3种类型:先雌后雄的黄鳝(Monopterus albus),在胚胎发育到第一次性成熟之前都表现为雌性,第一次繁殖后转变为雄性[32];先雄后雌的鲷科(Sparidae)鱼类,第一次性成熟为雄性而第二次性成熟为雌性[33];以及双向性别转变的白垩鱼(Serranus Tortugarum)[34]。Sheng等[32]在对黄鳝性腺转化过程中Dmrt基因的鉴定及其上调中研究发现,Dmrt4在黄鳝由卵巢经卵精巢向精巢性逆转过程中上调,且通过原位杂交发现在卵巢中Dmrt4主要在发育中的卵母细胞中,在精巢中Dmrt4位于生精上皮的外侧。在硬骨鱼中,一些典型的顺序型雌雄同体相关基因已被确定,如细胞色素P450家族19(Cyp19)、生长分化因子9(GDF9)、黄体生成素β(LBH)、卵泡刺激素β(FSHB)和抗苗勒氏激素(AMH),它们在性别转化中发挥重要作用[35⇓⇓⇓-39]。
本研究采用同源克隆和RACE技术,获得兰州鲇Dmrta1基因cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,发现该基因具有典型的DM和DMA保守结构域,且兰州鲇与南方鲇的同源关系最高。采用qRT-PCR对Dmrta1基因在兰州鲇胚胎发育、仔稚幼鱼、3龄雌雄异体和雌雄同体不同组织中的表达情况进行了分析,结果说明,Dmrta1基因在兰州鲇中属于母源基因,且该基因可能对兰州鲇早期胚胎发育与性别分化、性腺发育与维持、卵母细胞生长发育以及鳃弓形成发挥重要作用,为深入了解兰州鲇性别决定机制积累资料,为后续培育全雄兰州鲇提供理论依据。

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[39]
He Z, Wu Y S, Xie J, Wang T X, Zhang L H, Zhang W M. Growth differentiation factor 9(Gdf9)was localized in the female as well as male germ cells in a protogynous hermaphroditic teleost fish,ricefield eel Monopterus albus[J]. General and Comparative Endocrinolog, 2012, 178(2):355-362.doi:10.1016/j.ygcen.2012.06.016.
本文引用 [1]

基金

国家重点研发计划项目(2018YFD0901202)
宁夏重点研发计划项目(2017BN06)

45

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