【目的】试验旨在研究抗鸭甲肝病毒基因3型(Duck hepatitis A virus genotype 3,DHAV-3)的北京鸭专门化品系(即抗性品系Z7-R)与DHAV-3易感品系(Z7-S)的脂质代谢轮廓,并筛选品系间差异脂质标志物。【方法】选取2日龄Z7系DHAV-3抗性北京鸭和易感北京鸭各6只,采集血液与肝脏组织,进行血液生化指标测定与基于液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)的非靶向肝脏脂质组检测。采用t检验、偏最小二乘分析(PLS-DA)和差异倍数(FC)综合筛选品系间显著差异脂质。【结果】Z7-R系北京鸭血浆总胆固醇、低密度脂蛋白和磷脂含量均显著高于Z7-S系(P<0.05)。脂质组分析共鉴定到1 532个脂质代谢物,涵盖了脂肪酰(FA)、甘油酯(GL)、甘油磷脂(GP)、鞘脂(SP)、固醇脂(ST)5个大类。共筛选到84个显著差异脂质,其中甘油酯类主要为甘油三酯(TG),且Z7-R系含量均高于Z7-S系(P<0.05);甘油磷脂类主要为溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)和游离脂肪酸(FFAs),且Z7-R系含量均低于Z7-S系(P<0.05)。共筛选到10个显著差异的脂质显著富集到鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、甘油酯代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢通路中。【结论】脂质组学技术可用于区分北京鸭Z7-R系与Z7-S系,筛选到的10个显著差异脂质物质可作为潜在的DHAV-3抗性与易感性状相关生物标志物。

【目的】利用CRISPR/Cas9技术获得α-肌动蛋白1(actin alpha 1,ACTA1)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryo fibroblasts,PEFs),为后续在细胞水平上探究猪ACTA1基因功能及发掘友好基因座位奠定基础。【方法】通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背部皮下脂肪和背最长肌7种组织中的表达情况;利用CRISPOR在线网站在猪ACTA1基因第7外显子区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX330载体;通过T7E1酶切检测不同sgRNA活性,选择效率较高且符合目标的载体质粒共转染至PEFs中;利用有限稀释法筛选单克隆细胞,并对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定和脱靶分析。【结果】实时荧光定量PCR结果表明,ACTA1基因在背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。设计的3条sgRNA的基因编辑效率分别为24.87%(sgRNA1)、39.59%(sgRNA2)、36.93%(sgRNA3),综合切割位置和基因编辑效率,选用sgRNA1和sgRNA2共转染细胞。基因型鉴定结果表明,获得的69株单克隆细胞中有20株单克隆细胞发生了编辑,其中单等位基因片段敲除细胞3株,双等位基因片段敲除细胞1株,片段敲除效率为5.8%(4/69)。脱靶分析结果显示,在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建了ACTA1基因纯合敲除的PEFs,研究结果为进一步探究ACTA1基因对猪骨骼肌发育调控提供了技术支撑和理论基础,同时为挖掘猪组织特异性表达的友好位点提供新思路。

【目的】预测基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)的基本功能,揭示MGP基因在秦川牛中的组织表达规律以及在秦川牛前体脂肪细胞不同分化时期的表达特性,为进一步研究MGP基因对秦川牛脂肪发育调控的作用机制提供理论依据。【方法】运用生物信息学在线软件对多物种MGP蛋白进行相似性比对及系统进化树构建,并对牛MGP蛋白的理化性质、亚细胞定位等进行预测;使用油红O染色检验秦川牛前体脂肪细胞的分化效果;利用实时荧光定量PCR技术检测MGP基因在秦川牛不同组织中的表达情况,以及在前体脂肪细胞不同分化时期的表达特性。【结果】相似性比对结果显示,牛MGP蛋白与山羊的相似性最高(99%),与斑马鱼的相似性最低(31%)。系统进化树显示,牛和山羊的亲缘关系最近,与斑马鱼的亲缘关系最远。MGP基因编码103个氨基酸;理论等电点为9.27,偏碱性;总平均疏水指数为―0.630,为亲水性蛋白;含有Sec/SPⅠ类型的信号肽,无跨膜结构,属于分泌蛋白;存在5个丝氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点,具有包含γ-羧基谷氨酸(Gla)的GLA_domain;二级结构中α-螺旋占比最高(55.34%)。油红O染色结果确定了分离培养的前体脂肪细胞分化效果良好。实时荧光定量PCR结果显示,MGP基因在秦川牛心脏中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),在大肠和肾周脂肪中也有较高的表达水平,在小肠中的表达量显著低于其他组织(P<0.05);MGP基因在前体脂肪细胞不同分化时期呈现先升高后降低的表达趋势,在前体脂肪细胞诱导分化第2天的表达量显著高于其他时间点(P<0.05),第10天的表达量显著低于其他时间点(P<0.05)。【结论】试验预测了MGP蛋白基本的结构和功能;MGP基因在秦川牛心脏组织中表达量最高,在小肠组织中表达量最低;MGP基因在前体脂肪细胞不同分化时期表现出先升高后降低的表达趋势。

猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)属于小RNA病毒科萨佩罗病毒属,是一种无包膜单股正链RNA病毒。与其他猪肠道病毒相似,PSV主要通过粪-口途径传播,也可通过接触和气溶胶传播。仔猪对该病毒易感,其可引起仔猪神经系统、呼吸系统、消化系统等的功能紊乱,严重时可导致猪死亡,不同毒株之间毒力与组织嗜性存在差异。临床中PSV常与猪捷申病毒、猪流行性腹泻病毒、猪库布病毒等多种病毒混合感染,使其临床症状复杂、诊断难度增加,从而加快病毒传播速度。此外,PSV存在的基因重组现象及跨种传播风险,对养猪业造成潜在威胁。目前已有核酸水平、蛋白水平、血清学等多种检测方法可用于PSV的实验室检测,已有多种细胞系可建立其体外感染模型,用于该病毒的相关研究。截至目前,PSV的研究主要集中于流行病学研究及其分离鉴定,有关PSV感染和致病机制研究较少且无商品化疫苗和有效的抗病毒药物。笔者对PSV的病原学特征、流行病学、致病机制、临床防控等方面的研究进展进行综述,以期为PSV的进一步防控研究提供理论依据。

桑叶不仅营养价值高,而且富含桑叶黄酮、桑叶多糖、生物碱和γ-氨基丁酸等多种生物活性物质,这些活性物质对微生物具有多重功能。一方面,桑叶活性物质可以通过结合细菌或与细菌竞争生长所需底物,破坏细菌的结构和遗传物质,从而抑制有害菌的增殖;另一方面,肠道微生物在酶的辅助下可以将这些活性物质分解转化为生物活性更高或毒性更低的小分子物质,提升肠道中有益菌的相对丰度、增加肠道内乙酸和丁酸等短链脂肪酸的生成,促进紧密连接蛋白的合成,从而促进肠道的消化吸收,增强机体的抗氧化和免疫能力,维持动物的肠道屏障功能。良好的肠道状态是动物健康生长的重要保障。在现如今高度集约化养殖模式和饲料“禁抗”背景下,桑叶及其活性物质具有维持动物肠道健康等重要功能,是抗生素的理想替代品,可用于开发绿色、高效的饲料添加剂。笔者综合阐述了桑叶中主要的活性物质、活性物质与微生物的互作关系,以及桑叶及其活性物质对畜禽和水产动物肠道微生物的影响,并对桑叶资源未来研究的侧重点提出了自己的观点,以期为桑叶在畜禽和水产动物饲料中的应用提供参考资料。

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是一种主要通过粪-口途径传播的人兽共患病病原,被认为是引起人类急性肝炎的主要原因之一。HEV可被分为8种基因型,各基因型的分布与地域和工业化水平有关,其中HEV-3与HEV-4具有人兽共患的传播能力,能造成人类和各种动物宿主的感染。除人类外,猪是HEV最常见的宿主,随着研究的深入,发现HEV的宿主呈现多样性,包括牛、羊、鹿、兔和骆驼等多种动物,且各动物宿主之间存在跨物种传播的可能。HEV的跨物种传播是在人类和动物宿主频繁交流的过程中,通过适应性进化而形成的,受到宿主细胞受体和细胞因子的特异性差异限制。HEV基因重组有利于适应宿主的新毒株出现,也可能促进新的传播途径,从而促进HEV跨物种传播。通过对HEV传播途径的研究发现,基因型不同,传播途径也有所差异,而食用携带HEV的动物产品,特别是未煮熟的动物产品是造成人类感染HEV-3和HEV-4的主要原因。此外,水源的污染、职业暴露、输血与器官移植同样是HEV的重要传播途径。针对各种潜在的传播途径,可采取相关的防控手段对HEV进行预防,包括对动物食品进行充分的加热以灭活HEV、对水源进行消毒和净化、做好职业防护和疫苗注射等。为更好地了解和掌握HEV的流行规律,各地应加强对HEV的监测,并制定相关的防控策略。笔者从HEV病原学、跨物种感染和防控技术等方面进行综述,以期促进人们对HEV跨物种传播的深入认识并为HEV的防控提供参考。

卵母细胞玻璃化冷冻保存对加快优良品种繁育、提高畜牧生产效率、维持物种多样性、拯救濒危动物具有重要意义。目前玻璃化冷冻技术已广泛应用于猪、牛、羊等家畜卵母细胞的冷冻保存。然而,相较新鲜卵母细胞,冷冻-解冻后卵母细胞的成熟率、受精率、卵裂率及囊胚发育率仍然偏低,这显著影响卵母细胞冷冻保存的实际应用。冷冻损伤是制约卵母细胞保存效率与质量的关键。玻璃化冷冻引起卵母细胞透明带破裂、膜脂相变、DNA损伤、染色体异常及胞质内皮质颗粒分布异常、内质网和线粒体结构功能受损、纺锤体形态异常等结构损伤,以及引起细胞氧化应激和钙稳态失衡等生理状态紊乱,导致细胞发育能力降低。因此,认识冷冻损伤产生的原因及其损伤机制,有助于进一步提高卵母细胞冷冻保存效率,促进卵母细胞冷冻技术的提升。作者综述了家畜卵母细胞冷冻损伤类型,分析了冷冻损伤原因,针对不同类型的冷冻损伤提出了改善方法,并对其研究前景进行展望,旨在为提高卵母细胞冷冻保存效率和质量提供参考。

【目的】了解新疆某市鸡群E型禽白血病(E-avian leukosis)的感染情况及基因分子特征,为禽白血病的诊断和防控提供参考。【方法】本研究通过病理剖检、病理组织学观察、PCR检测、克隆载体连接等对疑似禽白血病病例进行实验室诊断,并通过DNAStar软件将分离株与参考毒株进行env基因核苷酸序列相似性比对、系统进化树构建和变异位点分析。【结果】发病鸡肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肺脏等器官肿大,有大小不一的白色结节状病灶。病理组织学观察病灶为大小一致的成淋巴细胞,呈局灶性、弥漫性分布。禽白血病病毒(Avian leukaemia virus,ALV)基因组PCR扩增结果显示,获得大小为302 bp的目的条带,为ALV阳性;对阳性样品进行分型鉴定,阳性样品出现大小为1 074 bp的ALV-E特异性条带,分别命名为AKS2101和AKS2102。序列分析结果显示,分离株与E亚群毒株序列相似性为91.6%～98.6%。系统进化树显示,所得序列与ALV-E亚群参考株处于同一分支,与A、B、C、D、J、K亚群参考株处于不同进化分支,进一步说明该鸡群存在ALV-E感染。基因变异分析显示,分离株存在24处核苷酸变异和17处氨基酸位点变异,且可变位点位于序列高变区。【结论】新疆某市鸡群存在ALV-E感染,本试验为明确该地禽白血病流行情况提供基础数据。

【目的】哺乳动物钠/肌醇共转运蛋白(sodium/myo-inositol cotransporter,SMIT)有2个同源体,分别是SMIT1和SMIT2,属于溶质载体(SLC)超家族。试验旨在探究青海湖裸鲤SMIT1、SMIT2基因对碱度环境的应答,为后续SMIT1和SMIT2基因在碱度环境下参与肌醇转运的分子机制奠定基础。【方法】利用PCR技术扩增、克隆SMIT1、SMIT2基因CDS区,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术检测SMIT1和SMIT2基因在淡水环境下青海湖裸鲤鳃、肾脏、脑等8个组织中的表达情况,以及不同碱度胁迫(0、J25、J50、J75、J100)下鳃和肾脏组织中2个基因表达的规律;利用气相色谱质谱法(GC-MS)检测不同碱度胁迫下鳃和肾脏组织中的肌醇含量变化。【结果】SMIT1基因CDS区为2 130 bp,共编码709个氨基酸,其氨基酸序列与犀角金线鲃相似性最高(86.5%),与多鳞白甲鱼亲缘关系最近;SMIT2基因CDS区为2 016 bp,共编码671个氨基酸,其氨基酸序列与多鳞白甲鱼的相似性最高(90.3%),与犀角金线鲃、多鳞白甲鱼的亲缘关系较近。SMIT1和SMIT2均属于溶质体超家族的SLC5家族成员,其中SMIT1蛋白包含2个SLC家族保守结构域。实时荧光定量PCR结果显示,淡水环境下SMIT1和SMIT2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,其中,SMIT1基因在脑和肾脏中表达量较高,SMIT2基因在肾脏中表达量最高,均显著高于其他组织(P<0.05)。随着碱度的升高,与对照组相比,J25、J50、J100时SMIT1基因在青海湖裸鲤鳃中表达量均显著升高(P<0.05),在肾脏中整体表达量均显著升高(P<0.05);J25时SMIT2基因在青海湖裸鲤鳃中表达量显著升高(P<0.05),J50、J75、J100时在肾脏中表达量均显著降低(P<0.05)。GC-MS结果显示,随着碱度的升高,青海湖裸鲤鳃中肌醇含量均显著高于对照组(P<0.05);肾脏中肌醇含量与对照组相比无显著变化(P>0.05)。【结论】SMIT1、SMIT2基因CDS区分别长2 130和2 016 bp,分别编码709和671个氨基酸,SMIT1基因在青海湖裸鲤脑组织中高表达,而SMIT2基因在青海湖裸鲤肾脏中高表达。不同碱度胁迫下SMIT1、SMIT2基因在青海湖裸鲤鳃、肾脏中的表达规律不同;肌醇含量在鳃组织中显著升高,且在J50时达到最高,在肾脏中变化不显著。研究结果为进一步探究青海湖裸鲤适应碱度环境的分子机制提供参考依据。

治疗性蛋白药物已成为药物开发的一个重要分支,由于其具有良好的临床获益和安全性,现已成为肿瘤、自身免疫等疾病治疗的重点研发药物。通过体外细胞表达的治疗性蛋白药物通常具有高度复杂性,因此,在开发或生产过程中建立一系列质量分析和评价标准来保证药物的一致性和安全性尤为重要。质谱技术已被广泛用于小分子药物开发,具有灵敏度高、选择性和特异性良好、高通量等优点,该技术已逐步成为治疗性蛋白药物质量分析研究的重要工具,用于治疗性蛋白药物结构表征、翻译后修饰分析、定量分析、杂质分析及相互作用等研究。笔者综述了常用于蛋白质分析的质谱组成,包括常见电离方式、解离方式和质量分析仪;在此基础上,对利用质谱技术进行治疗性蛋白药物定性、翻译后修饰(糖基化、二硫键)研究的一般样品处理方法和质谱方法进行分析,并对利用质谱技术进行蛋白质定量分析方法开发、样品前处理和常用分析程序进行分析阐述;同时,笔者也对抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate,ADC)表征、定量分析和其他质谱分析表征应用的一般方法进行总结。通过对上述内容研究分析,旨在为利用质谱技术加快兽用治疗性蛋白药物开发和研究提供参考和借鉴。

【目的】研究中药组方对犊牛源大肠杆菌致小鼠腹泻的治疗效果,为中药治疗大肠杆菌致犊牛腹泻提供参考依据。【方法】将162只小鼠随机分为9组,空白组、模型组、中药治疗组(2个组方各3个浓度(1.5、1.0、0.5 g/mL))和西药治疗组,每组3个重复,每个重复6只。除空白组外,其余各组小鼠腹腔注射0.5 mL 1×10~8 CFU/mL的大肠杆菌悬液,小鼠出现腹泻后,中药组小鼠分别灌喂0.2 mL不同浓度中药组方提取液(白头翁汤加减和乌梅散加减),西药组小鼠灌喂0.2 mL恩诺沙星,模型组小鼠灌喂0.2 mL蒸馏水,持续7 d。每天记录小鼠体重、采食量,治疗第3天时统计腹泻指数;治疗第7天剖检小鼠,检测小肠病理变化,利用ELISA法检测回肠黏膜分泌型免疫球蛋白(sIgA)、多聚免疫球蛋白受体(pIgR)含量,利用实时荧光定量PCR检测十二指肠Claudin-1、Occludin和ZO-1基因mRNA相对表达量。【结果】与模型组相比,经2个中药组方治疗后腹泻小鼠体重、采食量均可显著增加(P<0.05),腹泻指数显著降低(P<0.05),改善了小肠病理组织学病变,促进了肠绒毛损伤的修复。与模型组相比,2个组方均可显著提高小鼠肠黏膜sIgA、pIgR含量(P<0.05)及十二指肠Claudin-1、Occludin和ZO-1基因mRNA相对表达量(P<0.05)。1.0 g/mL乌梅散加减在2个中药组方中治疗效果最佳,与西药组相比,在小鼠肠组织形态、肠黏膜免疫球蛋白含量及紧密连接蛋白mRNA的相对表达量上不存在显著差异。【结论】乌梅散加减和白头翁汤加减均可降低小鼠腹泻指数,改善肠道病理损伤,其中乌梅散加减的治疗效果更显著,本研究可为中药治疗大肠杆菌致犊牛腹泻提供参考。

【目的】探究饲粮中添加胍基乙酸(guanidine acetic acid,GAA)和α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,LA)对绵羊瘤胃微生物和代谢物的影响。【方法】选取24只体重相近、体质良好的健康杜湖杂交公羊,随机分为4组,分别为对照组(CTL,饲喂基础饲粮)、GAA组(基础饲粮中添加1 500 mg/kg GAA)、LA组(基础饲粮中添加600 mg/kg LA)和MIX组(基础饲粮中添加1 500 mg/kg GAA和600 mg/kg LA),正试期60 d。试验结束后采集瘤胃液,利用16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学检测瘤胃菌群及其代谢物。【结果】在绵羊瘤胃液菌群门水平上,与对照组相比,GAA和MIX组帕特斯菌门(Patescibacteria)的丰度显著上调(P<0.05);LA和MIX组疣微菌门(Verrucomicrobiota)的丰度显著下调(P<0.05)。在绵羊瘤胃液菌群属水平上,与对照组相比,LA组奎因氏菌属(Quinella)的丰度显著降低(P<0.05);各试验组糖单胞菌属(Candidatus_Saccharimonas)的丰度显著升高(P<0.05),图氏杆菌属(Turicibacter)的丰度显著降低(P<0.05);GAA组隆氏菌科UCG-001属(Veillonellaceae_UCG-001)的丰度显著降低(P<0.05);MIX组瘤胃艾氏梭菌属(Eubacterium_Ruminantium_group)的丰度显著降低(P<0.05)。绵羊瘤胃菌群代谢途径分析显示,GAA组的差异代谢物11-羟基过氧十八碳二烯酸、8-甲氧基犬尿氨酸等主要参与色氨酸代谢通路;LA组的差异代谢物1-磷酸鞘氨醇、二氢神经酰胺等主要参与鞘脂信号通路和鞘脂类代谢通路;MIX组的差异代谢物8-甲氧基犬尿氨酸、单磷酸鸟苷、3-甲基吲哚等主要参与色氨酸代谢通路。【结论】饲粮中单独添加GAA或LA以及组合添加均能够调节绵羊瘤胃微生物群落组成和代谢功能。该结果有助于揭示GAA和LA作为添加剂的深层次原理。

【目的】探究A型产气荚膜梭菌在仔猪腹泻中的致病性,为A型产气荚膜梭菌感染所致腹泻的诊断和治疗提供理论依据和参考。【方法】通过培养特性和革兰染色镜检对分离菌进行初步鉴定,通过生化试验、毒素基因PCR扩增、16S rRNA序列比对并构建进化树对可疑菌株进一步鉴定,利用药敏试验和动物回归试验研究分离菌株的耐药性和致病性。【结果】分离菌株在TSN平板上呈黑色菌落,在血平板上呈α、β双溶血环,革兰染色呈紫色粗大杆菌。生化试验结果显示,分离菌株葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、还原性硝酸盐试验、H_2S试验和明胶液化均呈阳性,甘露醇、吲哚试验和水杨酸结果呈阴性。16S rRNA序列比对结果显示,分离菌与NCBI数据库中已公布的产气荚膜梭菌16S rRNA基因序列相似性均>99%,鉴定该菌株为产气荚膜梭菌。PCR扩增出plc及cpb2基因,表明该菌株为携带β2毒素的A型产气荚膜梭菌。药敏试验结果显示,分离菌株对青霉素G、庆大霉素、林可霉素、磺胺异噁唑、环丙沙星、诺氟沙星耐药。动物回归试验结果显示,攻菌后仔猪粪便中可检出大量产气荚膜梭菌,该菌株可引起仔猪腹泻,死亡率达50%;死亡仔猪剖检可见小肠充血、出血、鼓气,从脾脏、小肠中可分离出产气荚膜梭菌,且在损伤严重的空肠肠段中分离出高载量A型产气荚膜梭菌。【结论】本试验成功分离出1株A型产气荚膜梭菌,可引起新生仔猪发病,致病性较强,该研究结果为A型产气荚膜梭菌感染仔猪的诊断、流行病学调查、治疗提供了参考依据。

【目的】基于中国荷斯坦牛牧场实际数据,通过遗传分析得到5种常见疾病的遗传参数,为制定包含健康性状的奶牛育种方案提供科学依据,促进中国牛群健康水平遗传改良。【方法】基于全国30个奶牛场2019―2022年95 710头牛的230 826条产犊记录和121 811头牛的333 038条疾病记录,经过质控后整合形成表型数据集,根据每个个体每胎次内是否发生疾病定义其表型为0(健康)或1(发病);针对乳房炎(mastitis,MAST)、临床性酮病(ketosis,KET)、胎衣不下(retained placenta,RETP)、子宫炎(metritis,MET)和真胃变位(displaced abomasum,DA)性状,采用单性状重复力模型估计各性状方差组分,计算遗传力和重复力,用双性状重复力模型估计性状间的表型相关和遗传相关,模型中包含场年、胎次、产犊季节固定效应。通过卡方检验对比公牛估计育种值(estimated breeding value,EBV)排名前20位和后20位公牛后代的发病率,探究了对健康性状进行选择的效果。【结果】MAST、KET、RETP、MET、DA性状的遗传力分别为0.063±0.005、0.051±0.005、0.015±0.002、0.033±0.003和0.020±0.002,均为低遗传力性状;性状间的遗传相关在―0.110～0.684之间,其中KET和DA、MET和RETP之间表现出较强正相关,遗传相关达到0.648和0.402。针对所有性状,EBV排名前20位公牛的后代平均发病率均极显著低于排名后20位的公牛后代(P<0.01),其发病率差异为2.2～7.4倍。【结论】本研究中5种健康性状均为低遗传力性状,但健康性状具有选育价值,在奶牛育种中应兼顾对健康性状的遗传改良,实现平衡育种目标。

【目的】克隆牦牛丝氨酸蛋白酶抑制剂家族E成员1(serpin family E member 1,SERPINE1)基因序列,同时探究不同嫩度牦牛背最长肌组织中SERPINE1基因核苷酸序列差异,为进一步研究其对牦牛肉嫩度的影响提供试验数据。【方法】根据GenBank中牦牛SERPINE1基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增克隆获得高、低嫩度牦牛背最长肌中的SERPINE1基因序列全长,并对其结构及编码蛋白进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR检测不同嫩度牦牛背最长肌中SERPINE1基因表达量。【结果】高、低嫩度牦牛背最长肌组织中SERPINE1基因全长分别为8 315和8 318 bp,均编码402个氨基酸且氨基酸序列完全相同。高、低嫩度背最长肌组织中SERPINE1基因非编码序列中存在3个碱基缺失及22个碱基突变(4个碱基颠换、18个碱基转换)。牦牛SERPINE1基因核苷酸序列与普通牛、瘤牛、美洲野牛、绵羊、山羊、家猪、人、小鼠的相似性分别为99.26%、99.26%、99.59%、96.94%、97.02%、90.49%、86.52%和80.10%。SERPINE1蛋白是一个含有23个氨基酸信号肽的亲水性稳定膜外蛋白,位于细胞外,具有34个潜在磷酸化位点,包含1个反应中心环(reactive center loop,RCL)。SERPINE1蛋白二级结构主要由α-螺旋(44.78%)和无规则卷曲(35.32%)构成。实时荧光定量PCR结果显示,SERPINE1基因在高嫩度牦牛背最长肌中表达量极显著高于低嫩度牦牛背最长肌(P<0.01)。【结论】本研究成功从高、低嫩度牦牛背最长肌组织中克隆SERPINE1基因全长并进行了生物信息学特征分析,为后续研究SERPINE1基因参与调控牦牛肉嫩度机制提供理论参考。

【目的】鉴定山羊环状RNA(circular RNA,circRNA)铁氧还蛋白还原酶(circFDXR)的表达,建立其在山羊原代卵巢颗粒细胞中的高效表达方式。【方法】利用PCR扩增、DNA测序、RNase R酶消化、实时荧光定量PCR鉴定circFDXR的环状性质。通过核质分离、荧光原位杂交(FISH)检测circFDXR亚细胞定位。利用同源重组将circFDXR的线性序列无缝克隆至慢病毒载体pLC5-ciR,转染至293T细胞包装病毒后进行病毒滴度测定,并确定最佳感染复数(MOI),并以最佳MOI感染山羊原代卵巢颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR检测过表达效率,并测序验证circFDXR是否正确环化。【结果】山羊circFDXR主要定位于卵巢颗粒细胞的细胞质中,耐受RNase R酶的消化。成功构建circFDXR慢病毒过表达载体,浓缩病毒滴度为5.49×10~9 TU/mL,感染山羊卵巢颗粒细胞的最佳MOI为100。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达组circFDXR表达量极显著升高(P<0.01),测序结果显示过表达的circFDXR可以正确环化。【结论】circFDXR主要定位于卵巢颗粒细胞的细胞质中,相比线性RNA具有更高的稳定性。利用慢病毒包装的circFDXR在山羊原代卵巢颗粒细胞中可以正确环化,本试验结果为进一步研究circFDXR在山羊原代卵巢颗粒细胞中的功能奠定了理论基础。

【目的】运用网络药理学和体外细胞试验探究麻黄活性成分治疗血管痉挛的相关分子机制。【方法】从中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)、SwissTargetPrediction和PharMapper数据库获取麻黄的主要活性成分及作用靶点,通过DrugBank、GeneCards、OMIM数据库获取疾病靶点,取交集得到药物成分-疾病交集靶点。利用STRING数据库进行蛋白-蛋白互作(PPI)分析,通过Cytoscape 3.9.1软件筛选得到核心靶点与核心成分。采用Metascape平台进行GO功能与KEGG通路富集分析,AutoDock Vina平台进行分子对接。在此基础上,通过MTT法检测麻黄活性成分对血管紧张素Ⅱ所致血管平滑肌细胞(vSMCs)增殖影响的机制。【结果】麻黄的有效活性成分主要包括木犀草素、槲皮素、β-槲皮素、圣草酚、柚皮素、豆甾醇、山柰酚等,这些药物成分主要作用靶点488个,血管痉挛的相关靶点394个。麻黄防治血管痉挛有67个预测靶点,主要包括基质金属肽酶Ⅸ(MMP9)、MMP2、血管紧张素Ⅱ受体1型(AGTR1)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、表皮生长因子受体(EGFR)、一氧化氮合酶2(NOS2)等。对上述67个靶点进行富集分析发现,与正向调节细胞迁移、对外来刺激反应、对缺氧反应、血管生成正向调节等生物过程,等离子体膜、突触后膜、突触前膜、树突、膜筏、轴突末端等细胞组分,RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、配体激活序列特异性DNA结合、丝氨酸型内肽酶活性、肽链内切酶活性、酶结合、锌离子结合等分子功能,以及钙信号通路、血管平滑肌收缩、松弛素信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路(PI3K-Akt)、鞘脂类信号通路等途径相关。分子对接结果表明,麻黄主要活性成分木犀草素、槲皮素与关键靶点MMP2和MMP9结合具有稳定构象。体外试验结果表明,麻黄活性成分木犀草素能抑制血管紧张素Ⅱ所致vSMCs增殖,其机制可能与其抑制MAPK1信号转导通路的活化有关。【结论】麻黄多种活性成分通过作用于MMP2、MMP9、血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE)、NOS2等靶点治疗血管痉挛,本研究结果为麻黄活性成分治疗血管痉挛的作用机制研究提供了科学参考。

【目的】本试验通过研究添加不同比例餐桌剩余食物(RPL)对肉鸡后期生长性能、屠宰性能、肉质性状、免疫器官指数及血清生化指标的影响,旨在为RPL减量替代玉米豆粕和在肉鸡养殖中的应用提供数据支持。【方法】选择1日龄白羽肉仔鸡公鸡504只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复21只鸡。试验前期(第1～21天)饲喂相同饲粮;后期(第22～42天)设计4种饲粮,对照组饲喂玉米-豆粕基础饲粮,试验组分别饲喂添加10%、20%和30%RPL的饲粮(1/2 RPL替代玉米,1/2 RPL替代豆粕)。测定肉鸡后期生长性能,42日龄屠宰后测定屠宰性能、肉质性状、免疫器官指数及血清生化指标。【结果】与对照组相比,(1)添加10%、20%RPL对肉鸡生长性能影响不显著(P>0.05),添加30%RPL显著降低平均体重、平均日采食量、平均日增重(P<0.05),极显著提高料重比(P<0.01)。(2)添加10%、20%RPL对肉鸡屠宰率、全净膛率、胸肌率和腿肌率均无显著影响(P>0.05),但添加30%RPL显著降低胸肌率(P<0.05)。(3)饲粮中添加不同比例RPL对肉鸡免疫器官指数无显著影响(P>0.05),10%、20%RPL组肉鸡血清免疫球蛋白G(IgG)含量显著升高(P<0.05),30%RPL组血清超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低(P<0.05)。(4)添加不同比例RPL对肉鸡胸肌和腿肌肉色、24、48和72 h滴水损失、酸度、蒸煮损失及剪切力均无显著影响(P>0.05)。【结论】在肉鸡饲粮中添加10%～20%RPL对肉鸡后期生长性能、屠宰性能、肉质性状、免疫器官指数、血清生化指标等均无负面影响;RPL可替代常规饲粮中的玉米和豆粕在肉鸡养殖后期中应用。

【目的】通过准确估计安格斯牛断奶阶段体重及体尺性状遗传参数,衡量肉牛断奶阶段的生长和发育潜力,为安格斯牛的遗传改良提供理论依据。【方法】本研究通过DMU软件的DMUAI模块,应用约束最大似然法(AI-REML)结合EM算法估计了宁夏地区7个安格斯肉牛养殖场的3 173头断奶阶段安格斯牛的体重及体尺性状的遗传参数。【结果】根据遗传力估计值高低的划分标准,安格斯牛断奶阶段体重(BW)、体高(BH)、十字部高(HCH)、体斜长(BL)、胸围(CG)、腹围(AC)和管围(CC)的遗传力均属于高遗传力性状(h~2≥0.40)。相关性结果显示,除管围与其他性状的遗传相关(-0.06～0.44)和表型相关(-0.07～0.35)呈负相关或弱正相关外,其余各性状间的遗传相关(0.31～0.79)和表型相关(0.30～0.81)均呈现正相关。【结论】安格斯牛的生长性状具有改善的潜力,在制定安格斯牛的育种方案时建议考虑该阶段的生长发育性状。

【目的】本试验旨在研究蛋鸭饲粮中n-6/n-3多不饱和脂肪酸(n-6/n-3 PUFA)对鸭蛋中脂肪酸组成和咸蛋黄品质的影响。【方法】试验选用健康、体重相近的21周龄福建龙岩山麻鸭180只,随机分为2组,每组6个重复,每个重复15只鸭。分别饲喂玉米-豆粕(对照组)和玉米-豆粕-亚麻籽(试验组)饲粮,n-6/n-3 PUFA分别为16和8,试验周期为12周。饲养试验结束后,采集新鲜鸭蛋测定脂肪酸组成,腌制咸蛋,测定咸蛋黄内质特性、质构特性、风味和滋味。【结果】与n-6/n-3 PUFA 16饲粮相比,n-6/n-3 PUFA 8饲粮(1)增加了鲜蛋黄中C18∶0、C20∶0、C22∶0、C22∶1n9、C18∶2n6c、C18∶3n3、C20∶3n6、C20∶4n6、n-6 PUFA以及n-3 PUFA含量,降低了鲜蛋黄中n-6/n-3 PUFA(由10.20降至5.65,P<0.05);(2)降低了咸蛋黄的硬心率和硬心比重(P<0.05),不影响出油率和沙性(P>0.05);降低了咸蛋黄的硬度,增加了弹性(P<0.05),但黏附性、内聚性、胶黏性和咀嚼性无显著变化(P>0.05);降低了咸蛋黄中醇醚醛酮类的气味(P<0.05);降低了咸蛋黄的苦味和鲜味,增加了滋味的丰富性(P<0.05),对涩味和咸味无显著影响(P>0.05)。【结论】蛋鸭饲粮n-6/n-3 PUFA由16降为8时,可降低鲜蛋黄中n-6/n-3 PUFA,改善咸蛋黄品质和风味。

【目的】探究树鼩精子中的特异性钙通道CatSper生化特性及其在树鼩精子中的亚细胞定位,并阐明CatSper对树鼩精子运动的调控作用。【方法】选择性成熟、1～2岁龄雄性树鼩,用CO_2处死后采集树鼩精液,统计精子活力并提取蛋白质。利用Western blotting和免疫组化检测精子中CatSper家族存在情况及其亚细胞定位。通过显微镜观察不同钙离子通道抑制剂(CatSper抑制剂HC-056456,瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)抑制剂Capsazepine)与孕酮(P_4)共孵育后树鼩精子的运动度。使用钙离子探针法检测不同抑制剂和P_4共孵育对树鼩精子钙离子浓度的影响。【结果】树鼩精子中存在CatSper及TRPV1通道蛋白,CatSper定位于精子头部及鞭毛。与对照组相比,当HC-056456浓度为100、200、400、1 000 nmol/L时,树鼩精子运动度和钙离子浓度均显著降低(P<0.05),Capsazepine浓度为10、20、40μmol/L时,树鼩精子运动度和钙离子浓度均显著降低(P<0.05)。与Capsazepine组相比,HC-056456与P_4共孵育时,树鼩精子钙离子浓度明显升高,且当P_4浓度为10、20、30μmol/L时两组间差异显著(P<0.05)。Capsazepine、HC-056456与P_4共孵育时,两组间树鼩精子运动度无显著差异(P>0.05)。【结论】CatSper通道对树鼩精子运动和钙离子转运调控至关重要,通过P_4激活从而提高精子内钙离子浓度,本研究结果对于深入研究精子功能及精子受精能力调控机制具有重要意义。

【目的】了解鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)在广东部分地区的流行及遗传变异情况,阐明其遗传进化与全基因组的特征,为GAstV的防控提供理论基础。【方法】使用GAstV特异性引物对2021―2022年广东地区养鹅场内出现疑似痛风的36份鹅病料进行PCR检测,选取4份具有代表性的GAstV强阳性样品,利用鹅细小病毒、坦布苏病毒、禽流感病毒、新城疫病毒的特异性引物进行检测,以排除病料中存在其他常见的外源性病毒;在此基础上利用鹅胚及鸡肝癌细胞系(leghorn male hepatoma,LMH)对4份GAstV样品进行病毒的分离和纯化,使用透射电镜对病毒粒子的形态进行观察;设计7对特异性引物对4株GAstV进行全基因组扩增和测序,运用DNAStar软件对序列进行整理与拼接以获取GAstV的全基因组序列,利用MegAlign软件进行核苷酸相似性比对,并对关键氨基酸位点的变异情况进行分析,应用Mega-X软件对全基因及单个ORF基因(ORF1a、ORF1b、ORF2)进行系统进化树构建。【结果】经PCR鉴定发现被检样品中共有30份是GAstV阳性,选取的4份代表性GAstV阳性样品均不存在其他外源性病毒感染,利用鹅胚及LMH细胞成功分离出了该4株GAstV病毒,并获得了4株全长均为7 131 bp的GAstV基因组序列,包括18 bp的5′-UTR和184 bp的3′-UTR、3个阅读开放框(ORF1a、ORF1b和ORF2基因),其中ORF1a、ORF1b和ORF2基因分别长3 255、1 551和2 115 bp,与报道的GAstV全基因组特征基本一致。相似性分析显示,4株GAstV之间的核苷酸相似性在99.4%～99.8%之间,与GenBank收录的其他19株GAstV的核苷酸相似在57.6%～99.6%之间。全基因组及3个ORF基因的遗传进化分析显示,获得的4株GAstV均属于GAstV-Ⅱ型。氨基酸序列分析显示,4株GAstV的氨基酸存在22处位置上的突变,其中ORF1a基因有8处突变,ORF2基因有14处突变。【结论】分离的4株GAstV均为GAstV-Ⅱ型毒株,与中国其他地区流行的基因型基本一致,该4株病毒的氨基酸突变主要发生在ORF1a和ORF2区域,为后续疫苗研发、流行病学调查及致病机理等方面提供参考依据。

【目的】探究蛹虫草、灵芝、黄芪、五味子、党参、当归、茯苓复方中药制剂对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响。【方法】建立H22荷瘤小鼠模型,随机将小鼠分为模型组、复方中药制剂高(250 mg/(kg·d))、中(50 mg/(kg·d))和低(10 mg/(kg·d))剂量组,各剂量组灌胃给药,1次/d,模型组灌胃同等体积生理盐水,试验期3周,另设置正常组进行常规饲喂。末次给药后采集抗凝全血,检测小鼠血细胞数量、血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)、细胞因子水平。用流式细胞术检测外周血CD4~+/CD8~+ T细胞亚群;通过小鼠脾淋巴细胞转化试验、碳粒廓清试验考察荷瘤小鼠免疫活性。【结果】与正常组相比,模型组小鼠血液中白细胞(WBC)、血小板(PLT)、淋巴细胞(W-SCR)数量极显著或显著减少(P<0.01;P<0.05),白细胞介素-2(IL-2)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量、SOD、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性以及细胞色素C(Cyt C)浓度均极显著或显著降低(P<0.01;P<0.05)。与模型组相比,高、中和低剂量组小鼠血清IL-2、IL-6、TNF-α含量和SOD、Caspase-3活性均极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05),MDA含量均极显著或显著降低(P<0.01;P<0.05);中剂量组小鼠血液中WBC、PLT数量极显著或显著增加(P<0.01;P<0.05);高剂量组小鼠血液中PLT数量极显著增加(P<0.01),Cyt C浓度显著升高(P<0.05)。流式细胞检测结果显示,模型组小鼠血液T淋巴细胞CD4~+、CD8~+亚群细胞数量较正常组显著减少(P<0.05)。与模型组相比,复方中药制剂高、中剂量组小鼠血液T淋巴细胞CD4~+、CD8~+亚群细胞数量显著增加(P<0.05),高、中剂量组小鼠刺激指数、半数溶血值和吞噬指数均极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05)。【结论】复方中药制剂能提高H22荷瘤小鼠免疫活性,进而促进肝癌细胞凋亡。

【目的】制备可特异性识别基因1型鹅星状病毒(Goose astrovirus genotype 1,GAstV-1)且与GAstV-2不发生交叉反应的多克隆抗体,以期为后续GAstV-1免疫检测技术的建立提供材料。【方法】通过比对GAstV-1与GAstV-2衣壳蛋白的氨基酸序列以寻找其差异较大的区域作为靶基因。对GAstV-1 GDYJ-21-01株VP27基因密码子进行偏嗜性优化合成,构建原核表达质粒pCZN1-GAstV-1 VP27,转化大肠杆菌Top10感受态细胞以诱导表达VP27蛋白;将纯化后的VP27蛋白免疫新西兰白兔后收获抗血清以制备GAstV-1 VP27多克隆抗体,通过间接ELISA和SDS-PAGE分析该纯化抗体的效价和纯度,并利用间接免疫荧光试验(IFA)检测多克隆抗体的特异性。【结果】试验成功构建重组质粒pCZN1-GAstV-1 VP27;SDS-PAGE显示其表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA试验结果显示,纯化后的GAstV-1 VP27多克隆抗体效价高达1∶9 841 500,纯度高于85%。IFA结果显示,GAstV-1 VP27多克隆抗体可特异性识别GAstV-1,且与GAstV-2无交叉反应。临床病料组织检测结果显示,GAstV-1核酸阳性的病料组织均可出现特异性荧光,而GAstV-2核酸阳性且GAstV-1核酸阴性的病料组织未出现荧光。【结论】本研究获得了高效价且可特异性识别GAstV-1(与GAstV-2无交叉反应)的VP27多克隆抗体,为建立鉴别诊断GAstV-1的抗原免疫检测技术奠定了基础。

在现代集约化养殖过程中,家禽容易产生各种应激反应,如免疫应激、热应激、冷应激、氧化应激和密度应激等。各种应激因素对家禽的生长、免疫力、抗病力以及肉蛋品质等方面产生不利影响。肠道微生物区系在营养交换、免疫系统调节、排除病原体等方面发挥着重要作用。应激与肠道微生物存在着双向的影响机制,应激能够影响肠道菌群的组成和功能,导致肠道菌群失调,从而影响家禽的健康和生产性能。同时,肠道菌群也可以通过微生物-肠-脑轴相互作用影响大脑的功能,从而改变行为和情绪。微生物-肠-脑轴是一种复杂的神经环路,它包括肠道、神经、免疫和内分泌系统之间的相互作用。肠道菌群通过产生代谢产物、调节免疫功能和影响神经传递等方式影响微生物-肠-脑轴的功能。此外,肠道菌群还可以干扰神经递质的代谢,从而对大脑功能产生影响。作者综述了家禽生长过程中面临的几种应激挑战及应激与肠道微生物之间通过微生物-肠-脑轴的双向交流,旨在为生产应用中通过调节肠道菌群来缓解应激提供理论依据。

中国海岸线长,大型海藻种类丰富,包含红藻、褐藻和绿藻。主要的栽培种类有海带、裙带菜、紫菜、龙须菜等。近年来,中国大型海藻年产量约在1 940万t。大型海藻作为一种可持续利用的海洋资源,富含蛋白质、脂肪酸、矿物质等营养物质和多糖、多酚、卤代化合物、萜类等功能性成分,这些功能性成分对反刍动物的生长发育和机体健康皆有益处,且能减少反刍动物甲烷排放,缓解全球变暖,具有无残留、无耐药性的特点,在成为绿色、功能性饲料或饲料添加剂方面极具潜力。作者就大型海藻的生物活性物质及其生理功能,以及在反刍动物瘤胃内环境调控、改善抗氧化能力和免疫性能、提升生产性能以及减少温室气体排放等方面的应用进行了综述,以期为大型海藻资源的开发与利用提供参考。

【目的】明确喀喇昆仑-帕米尔地区山羊群体遗传多样性及系统发育情况,为山羊种质资源保存、发掘和利用提供理论依据。【方法】以分布于喀喇昆仑-帕米尔地区的山羊为研究对象,对其线粒体(mtDNA)非编码序列置换环(D-loop)区和细胞色素b(Cytb)基因序列进行PCR扩增并测序。利用Mega 7.0.26软件分析碱基组成,结合从GenBank中下载的山羊mtDNA D-loop区序列和Cytb基因序列绘制系统发育树,使用DNASP 5.10软件统计单倍型分布并进行中性检验,通过Network 10.2软件构建单倍型中介网络图。【结果】喀喇昆仑-帕米尔地区山羊mtDNA D-loop区序列和Cytb基因序列AT含量分别为60.1%和58.7%,AT含量均高于GC含量,具有碱基组成偏好性。D-loop区序列和Cytb基因分别存在163和84个SNPs位点,分别定义40、30种单倍型,单倍型多样性(Hd)分别为0.985和0.883,核苷酸多样性(Pi)分别为0.01570和0.00425。mtDNA D-loop区和Cytb基因的中性检验Tajima’s D值和Fu’s Fs值均<0,显著偏离中性,核苷酸错配分布图呈现3个峰。系统发育树分析表明喀喇昆仑-帕米尔地区山羊包含4个支系,分别为A、B、C、G。【结论】喀喇昆仑-帕米尔地区山羊至少经历过3次群体扩张事件,遗传多样性丰富,西亚地区的山羊对其存在基因渗入,同域的北山羊对其没有遗传贡献。

【目的】克隆简州大耳羊肌节线粒体肌酸激酶2(creatine kinase mitochondrial 2,CKMT2)基因并探究其生物学特征,明确其在简州大耳羊不同组织以及不同分化阶段成肌细胞中的表达特性。【方法】采集简州大耳羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、臂三头肌组织样品,利用PCR方法扩增简州大耳羊CKMT2基因并克隆测序,通过在线软件对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术检测CKMT2基因在简州大耳羊不同组织及不同分化阶段成肌细胞中的表达水平。【结果】简州大耳羊CKMT2基因全长1 314 bp,其中包括CDS区1 259 bp,编码419个氨基酸,与绵羊和羚羊的亲缘关系最近。CKMT2蛋白是一种无信号肽及跨膜结构域的碱性亲水稳定蛋白,主要定位于线粒体、过氧化物类酶体及细胞质,共包含32个磷酸化位点、1个N-糖基化位点以及4个O-糖基化位点。蛋白二级结构主要包括α-螺旋(39.14%)、无规则卷曲(36.28%)、延伸链(16.23%)和β-转角(8.35%),三级结构与二级结构预测结果基本一致。蛋白互作分析结果显示,CKMT2蛋白与半胱氨酸和甘氨酸富含蛋白3(cysteine and glycine-rich protein 3,CSRP3)、M型肌酸激酶(creatine kinase M-type,CKM)、磷酸甘油酸变位酶2(phosphoglycerate mutase 2,PGAM2)等蛋白存在相互作用。组织表达谱结果显示,CKMT2基因在简州大耳羊心脏中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05);在背最长肌中表达量较高,显著高于脾脏和臂三头肌(P<0.05)。时序表达谱结果显示,简州大耳羊CKMT2基因在成肌细胞诱导分化4 d时表达水平达到峰值,显著高于0、6 d(P<0.05)。【结论】本研究成功克隆简州大耳羊CKMT2基因序列并明确了其分子特征,其在心脏、背最长肌以及成肌分化4 d时表达量较高。研究结果为进一步揭示CKMT2基因调控简州大耳羊成肌细胞增殖分化的分子机制奠定基础。

【目的】探究1株来自枸杞果实的贝莱斯芽孢杆菌lut-Y1的生长特性及抑菌活性,为微生态制剂的开发和应用提供参考。【方法】通过形态观察和16S rDNA基因测序分析对该菌株进行鉴定;测定该菌株生长曲线及最适pH、碳源、氮源及盐耐受度;采用平板对峙法观察该菌株对链格孢菌(Alternaria alternate)、小麦根腐离蠕孢(Bipolaris sorokiniana)和小孢壳二孢(Ascochyta leptospora)的颉颃作用,并分析该菌株发酵液对3种病原真菌的抑菌活性。【结果】lut-Y1菌株在LB、NA和PDA培养基上均生长良好。根据形态和16S rDNA基因序列特征将lut-Y1菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。在LB液体培养基中,lut-Y1菌株在0～3 h为迟滞期,3～18 h为对数期,18～62 h为稳定期,62 h后进入衰亡期;最适pH为7.0,最适碳源和氮源分别为蔗糖和蛋白胨,对NaCl的耐受量不超过2.0 g/L。lut-Y1菌株对链格孢菌有明显的颉颃作用,对小麦根腐离蠕孢和小孢壳二孢的颉颃作用较弱。对峙平板的两菌交界处,链格孢菌基内菌丝细弱、弯曲;小麦根腐离蠕孢基内菌丝细胞壁被破坏,有泡状突起。发酵液添加量为25%时生长圈直径分别缩小72.80%和83.24%。【结论】贝莱斯芽孢杆菌lut-Y1具有较好的抑菌活性,可为开发以芽孢杆菌为主要活性成分的微生态制剂提供材料。

【目的】研究小麦粉碎粒度对1～20日龄817肉公鸡生长性能、肠道形态、消化酶活性及血清生化指标的影响。【方法】选取1日龄817肉鸡(公)360只,按体重无差异原则随机分为3个处理组,每个处理组6个重复,每个重复20只鸡。对照组为玉米-豆粕型饲粮,2个试验组(1.5 mm和2.5 mm组)饲粮添加小麦和非淀粉多糖酶,小麦添加量为25%,分别通过1.5和2.5 mm孔径的筛片粉碎。试验期为20 d,20日龄时测定肉鸡生长性能;采集肠道组织与内容物、胰腺组织及肉鸡血液,测定肠道组织形态、消化酶活性及血清生化指标。【结果】与对照组相比,(1)1.5、2.5 mm组肉鸡生长性能均无显著差异(P>0.05),但1.5 mm组肉鸡终末体重与平均日增重显著高于2.5 mm组(P<0.05);(2)两个试验组肉鸡肠道形态均显著改善(P<0.05),且1.5 mm组改善效果优于2.5 mm组;(3)1.5 mm组肉鸡十二指肠α-淀粉酶、脂肪酶和空肠胰蛋白酶活性均显著提高(P<0.05),2.5 mm组肉鸡十二指肠α-淀粉酶和空肠胰蛋白酶活性均显著提高(P<0.05),十二指肠脂肪酶活性显著降低(P<0.05);1.5 mm组肉鸡空肠胰蛋白酶活性显著高于2.5 mm组(P<0.05);(4)1.5 mm组肉鸡血清总胆固醇含量显著下降(P<0.05),2.5 mm组谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性均显著上升(P<0.05);1.5 mm组血清总胆固醇含量、谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性均显著低于2.5 mm组(P<0.05)。【结论】在本试验条件下,饲粮中用不同粉碎粒度的小麦替代玉米(25%替代)对1～20日龄817肉公鸡无不良影响,小麦粉碎粒度为1.5 mm时,肉鸡生长性能、肠道形态、消化酶活性及血清生化指标最佳。

【目的】了解1株分离自调理肉制品的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)携带耐药基因、毒力基因、可移动元件情况以及遗传进化关系。【方法】以1株从新疆某地的调理肉制品中分离获得的LM菌株LM5567为研究对象,通过VITEK-2 Compact和AST-GP67药敏卡检测LM5567菌株耐药性;经全基因组测序后,对LM5567菌株进行功能注释、分子分型、遗传进化关系和耐药基因、毒力基因及可移动元件携带情况分析。【结果】LM5567菌株对苄青霉素、氨苄西林、苯唑西林、呋喃妥因、复方新诺明、四环素等抗菌药均有耐药性,其基因组全长为2.974 Mb,包含2 941个编码基因。通过GO注释共获得2 144个基因,包含了50种功能特性。多位点序列分型(MLST)分析结果显示,LM5567菌株为ST515型,与分离自不同国家的复合克隆系(clonal complex,CC)CC1菌株具有较近亲缘关系。单核苷酸多态性(SNP)分析表明,LM5567菌株与来自加拿大的菌株02＿17924b、02＿1103和1株来自波兰的菌株220的突变位点最少,该菌株携带88个毒力基因和6个耐药基因,存在1个转座子Tn6009并携带四环素耐药基因tetM。【结论】食源性LM5567菌株为ST515型多重耐药菌株,基因组携带多种耐药基因、毒力基因和1个转座子,具有发生耐药性转移的潜力,存在通过食物链传播引起人类李斯特菌病的潜在风险。

【目的】研究三叶青藤叶粉(THL)对崇仁麻鸡生长性能、血清抗氧化和免疫功能及空肠形态结构的影响。【方法】试验选用360只50日龄崇仁麻鸡母鸡,随机分为5组(每组6个重复,每个重复12只),对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加0.5%、1%、2%和4%三叶青藤叶粉,试验期56 d。试验结束时以重复为单位称重,记录肉鸡采食量,统计生长性能指标;采集血液和肠道组织样品,检测血清抗氧化、免疫指标,制备空肠组织切片并观察空肠形态,测量空肠绒毛高度和隐窝深度,统计绒隐比(V/C)。【结果】与对照组相比,饲粮中添加1%三叶青藤叶粉后崇仁麻鸡料重比(F/G)显著降低(P<0.05),血清免疫球蛋白A(IgA)、IgM、转化生长因子-β(TGF-β)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高(P<0.05),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05);添加2%三叶青藤叶粉后血清IgA、TGF-β含量显著升高(P<0.05),白细胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α含量显著降低(P<0.05);添加4%三叶青藤叶粉后血清TGF-β含量显著升高(P<0.05),IL-1β含量显著降低(P<0.05);饲粮中添加0.5%和1%三叶青藤叶粉后空肠绒毛高度和V/C显著增加(P<0.05)。【结论】饲粮中添加0.5%～4%三叶青藤叶粉能在一定程度上促进崇仁麻鸡生长,提高机体免疫力,改善肠道组织形态,本试验条件下三叶青藤叶粉添加水平为1%～2%效果较好。

【目的】制备猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)及其单克隆抗体,为建立猪源SLPI检测方法及其功能研究提供试验材料。【方法】将经串联的猪源SLPI基因克隆至pET-28a(+)、pGEX-6P-1载体构建重组表达载体;利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达情况;重组菌经超声破碎以镍柱对重组蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合制备杂交瘤细胞,采用间接ELISA筛选和鉴定所制备单克隆抗体和亚类,利用Western blotting及间接免疫荧光(IFA)方法鉴定单克隆抗体的特异性。【结果】试验成功构建了pGEX-6P-1-SLPI、pET-28a-SLPI重组质粒,获得纯度较高的His-SLPI、GST-SLPI重组蛋白,分子质量分别为27和50 ku,前者为包涵体表达,后者为可溶性表达;获得3株可稳定分泌抗猪SLPI单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中,9D10为IgG3亚类,9G11、10E2为IgG2b亚类;3株单克隆抗体均可与猪肠上皮细胞内的SLPI结合,9D10在细胞核中显示较强的荧光信号,而9G11、10E2在细胞浆和细胞核中均有荧光信号。【结论】本研究成功制备了重组His-SLPI和GST-SLPI蛋白,获得3株稳定分泌抗猪源SLPI单克隆抗体,特异性良好,为进一步研究猪源SLPI特性及其在黏膜免疫中的作用搭建技术平台。

【目的】研究核桃青皮粉及其提取物对育肥猪生长性能、胴体和肉质性状的影响。【方法】选取90头健康、体重约80 kg的“杜×长×大”三元杂交育肥阉公猪,随机分为3组,每组3个重复,每个重复10头猪。对照组育肥猪饲喂基础饲粮,核桃青皮粉试验组及其提取物试验组分别在基础饲粮中添加0.1%核桃青皮粉和0.1%核桃青皮粉提取物。预试期10 d,正试期40 d。试验第41天,测定每头猪初始体重、终末体重及各组采食量。试验结束后,每个重复中选取2头体重接近平均体重的试验猪进行屠宰,测定胴体性状、肉质性状,以及背最长肌的氨基酸和脂肪酸含量。【结果】与对照组相比,饲粮中添加核桃青皮粉或其提取物对育肥猪末重、平均日增重、平均日采食量、料重比、胴体直长、胴体斜长、胴体重、屠宰率、眼肌面积、板油重以及背最长肌pH_(45 min)、滴水损失、加压损失、大理石纹评分、红度均无显著影响(P>0.05),但可显著提高育肥猪背膘厚、背最长肌黄度和肌内脂肪含量(P<0.05)。与对照组相比,除了组氨酸,核桃青皮粉组育肥猪背最长肌中其他氨基酸含量均有一定提高,而核桃青皮提取物组的氨基酸含量与对照组的差异不大,核桃青皮粉组和提取物组多不饱和脂肪酸总含量均比对照组含量有一定提高。【结论】饲粮添加0.1%核桃青皮粉及其提取物对生长性能和胴体性状无负面影响,二者均可改善育肥猪肉质性状,核桃青皮粉效果更佳。

【目的】探究二氢杨梅素(DHM)对雏鸡免疫器官指数、免疫器官组织学形态及血清中免疫因子含量的影响。【方法】选取150只7日龄海兰白蛋雏鸡,雌雄各半,随机分为5组,每组30只,对照组给予基础饲粮,给药组分别在基础饲粮中添加0.025%、0.05%、0.1%、0.2%DHM。试验于给药7、14、21、28及35 d时,每组随机选取6只雏鸡心脏采血,收集免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊)分别称重,计算不同给药组雏鸡免疫器官指数,检测血清免疫球蛋白G(IgG)、补体(C3、C4)含量,并对给药35 d时雏鸡免疫器官进行HE染色观察组织形态。【结果】与对照组相比,0.2%DHM组在给药35 d时雏鸡胸腺指数显著升高(P<0.05),0.2%DHM组在给药28和35 d时雏鸡脾脏指数均显著升高(P<0.05),0.1%、0.2%DHM组雏鸡法氏囊指数在给药7 d时显著增高(P<0.05)。饲粮中添加DHM后雏鸡免疫器官细胞排列整齐、淋巴细胞数量增多、结构更加致密。与对照组相比,0.05%、0.1%、0.2%DHM组在给药28和35 d时雏鸡血清IgG含量均显著增加(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清IgG含量在给药21和28 d时显著高于其他组,在35 d时显著高于0.025%和0.05%DHM组(P<0.05)。与对照组相比,0.1%、0.2%DHM组雏鸡血清中补体C3含量在不同给药时间均显著升高(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清补体C3含量在给药14和28 d时显著高于其他组,在21和35 d时显著高于0.025%和0.05%DHM组(P<0.05)。与对照组相比,0.05%、0.1%和1.2%DHM组在14、28和35 d时雏鸡血清补体C4含量显著升高(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清补体C4含量在给药14、21和28 d时显著高于其他组,在35 d时显著高于0.025%DHM组(P<0.05)。【结论】饲粮中添加0.2%DHM能促进雏鸡免疫器官生长发育,并且能提高雏鸡免疫因子的表达,增强雏鸡免疫功能。

【目的】制备鼠伤寒沙门菌Sal-14028 SptP蛋白的多克隆抗体,并将其应用于沙门菌SptP蛋白的检测。【方法】以Sal-14028基因组DNA为模板,PCR扩增SptP基因片段,构建原核表达质粒pET28a-SptP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组SptP蛋白。表达产物经镍柱纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测抗体效价和特异性。采用细胞免疫荧光检测感染沙门菌的Raw264.7细胞中SptP的分布,免疫沉淀检测感染细胞总蛋白,取25 ku的条带酶解后进行质谱鉴定。【结果】克隆得到大小为1 173 bp的SptP基因片段,酶切和测序结果表明重组质粒pET28a-SptP构建成功,诱导表达和纯化得到了大小约为45 ku的重组SptP蛋白。重组SptP蛋白免疫家兔获得了效价为1∶25 600的多克隆抗体,该抗体可识别重组SptP蛋白和沙门菌SptP全蛋白,可跟踪沙门菌感染的细胞内SptP的分布。免疫沉淀试验结果表明,该抗体可结合多个蛋白,质谱/肽指纹图谱鉴定表明,该抗体结合的25 ku蛋白为鼠Rac1蛋白。【结论】本研究成功制备了效价高、能识别重组SptP蛋白和SptP全蛋白的多克隆抗体,可用于Western blotting、细胞免疫荧光和免疫共沉淀试验研究,本研究结果为沙门菌SptP蛋白的检测和SptP互作分子的挖掘研究奠定基础。

【目的】探究干扰素刺激基因ISG15在猪流行性腹泻病毒(PEDV)复制中所发挥的作用及机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测ISG15基因组织表达谱及肠道组织差异表达情况,同时以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究模型,检测PEDV CV777毒株感染细胞不同时间点PEDV M基因mRNA和N蛋白表达量,并从RNA和蛋白水平检测ISG15表达变化;分别构建猪ISG15基因干扰和过表达细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验检测ISG15基因表达对PEDV复制水平的影响;对ISG15基因过表达前后进行转录组测序分析,筛选其下游调控基因及信号通路。【结果】ISG15基因在仔猪肠道组织中特异性高表达,其中空肠和回肠中表达量极显著高于其他组织(P<0.01);PEDV感染组十二指肠、空肠及回肠中ISG15基因表达量显著或极显著高于健康组(P<0.05;P<0.01);M基因mRNA和N蛋白表达量出现上升趋势,与0 h相比,ISG15基因表达水平在24 h出现极显著上调(P<0.01);ISG15基因过表达后PEDV复制出现显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01),而ISG15基因干扰后PEDV复制出现极显著上调(P<0.01);转录组测序发现,过表达ISG15基因前后存在1 532个差异表达基因,且其主要富集在自噬、MAPK、内吞等信号通路中。【结论】本研究揭示了PEDV感染过程中ISG15基因的调控功能及作用机制,发现ISG15基因上调可显著抑制PEDV复制,增进了对PEDV与宿主细胞互作分子机制的认识。

【目的】研究角蛋白10(keratin 10,KRT10)基因多态性对柯乐猪繁殖性状的影响,以提高柯乐猪的繁殖力。【方法】以255头柯乐猪为研究对象,采用PCR产物测序、DANMAN序列比对软件及人工校对相结合的方法鉴定KRT10基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,利用SHEsis在线软件分析SNP位点的群体遗传特性,通过RNAfold在线工具对SNP位点进行生物信息学分析,使用SPSS 22.0软件中的一般线性模型分析KRT10基因SNP位点与柯乐猪繁殖性状的关联性。【结果】在柯乐猪KRT10基因中共鉴定到3个SNPs位点:第4内含子的g.21643703 C>T和g.21643714 G>A;第5外显子的g.21643741 G>A。g.21643741 G>A突变导致密码子由AAG突变为AAA,编码氨基酸均为赖氨酸(K),为同义突变,引起编码的mRNA二级结构发生改变。3个SNPs位点均检测到3种基因型,g.21643703 C>T和g.21643741 G>A属于中度多态位点(0.25A属于低度多态位点(PIC<0.25)。g.21643703 C>T和g.21643741 G>A位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),g.21643714 G>A位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05);3个SNPs位点间均不存在强连锁不平衡。KRT10基因3个SNPs位点共产生4种单倍型和10种双倍型。关联分析结果表明,g.21643703 C>T位点对柯乐猪初生窝重、断奶仔数和断奶窝重的影响均达到显著水平(P<0.05);g.21643714 G>A位点对柯乐猪总产仔数和断奶窝重的影响均达到显著水平(P<0.05);g.21643741 G>A位点对柯乐猪总产仔数、产活仔数、断奶仔数和断奶窝重的影响均达到显著水平(P<0.05)。双倍型H3H3对柯乐猪总产仔数、产活仔数、断奶仔数和断奶窝重的影响最明显。【结论】KRT10基因中存在的3个SNPs位点对柯乐猪繁殖性状有显著影响,其中H3H3为有利双倍型,可作为柯乐猪繁殖性状选择的遗传标记。

【目的】本研究以小鼠作为试验对象,探究利司培酮能否促进哺乳动物乳腺发育及后代生长。【方法】将20只雌性昆明小鼠分为2组,每组10只。试验组小鼠在怀孕后期饲喂含0.25 mg/L利司培酮的饮水,连续饲喂4 d,对照组小鼠饲喂不含利司培酮的饮水。每组在哺乳第3和18天各采集5只小鼠乳腺组织及血液。应用ELISA方法检测血清中催乳素(PRL)水平,HE染色法观察乳腺组织形态学变化,通过称重和计数方法统计2组间母鼠乳腺重量及幼鼠平均体重和存活率差异情况,对2个时期的乳腺进行转录组测序,并对测序数据进行GO、KEGG和GSEA富集分析。【结果】哺乳第3天时利司培酮组小鼠血清PRL水平极显著高于对照组(P<0.01);哺乳第3和18天利司培酮组小鼠乳腺丰富程度高于对照组;哺乳第18天时利司培酮组母鼠乳腺重量及其幼鼠平均体重和存活率均显著高于对照组(P<0.05);GO功能富集分析结果显示,哺乳第3天2组小鼠乳腺组织的差异表达基因主要集中在脂肪酸代谢、脂肪细胞分化等生物过程,哺乳第18天利司培酮处理组母鼠的差异表达基因主要集中在脂肪酸代谢过程的负调控、组织重塑等生物过程;KEGG通路富集分析结果显示,哺乳第3天的差异表达基因主要富集于PPAR信号通路、cAMP信号通路、脂肪消化吸收等途径,哺乳第18天的差异表达基因主要在PPAR信号通路、脂肪细胞脂解作用的调控等途径最为富集;GSEA富集分析结果显示,哺乳第3和18天两时期的利司培酮处理组均富集到了雌激素和PRL信号通路。【结论】给怀孕后期母鼠饲喂利司培酮,可促进母鼠乳腺发育和幼鼠生长。本研究揭示了利司培酮对小鼠乳腺发育的促进作用,为将来建立在怀孕后期母畜饮水中添加利司培酮来提高泌乳和促进后代生长的新方法奠定基础,对于促进哺乳动物繁殖和养殖效率提高具有重要意义。

【目的】体外表达滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的GA组件蛋白(GA module-containing protein),建立一种MS抗体检测方法,用于血清学检测及MS抗体水平监测。【方法】分析、筛选MS的GA组件蛋白长链保守结构域,合成重组质粒pET30a-ΔGA-L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,并优化表达条件;通过SDS-PAGE检测重组蛋白的表达,纯化重组蛋白ΔGA-L并进行Western blotting鉴定;以纯化后的重组蛋白ΔGA-L作为包被抗原,建立MS抗体的间接ELISA检测方法,优化反应条件,确定临界值,对其特异性、敏感性、重复性进行检验,并进行临床样品检测。【结果】重组蛋白ΔGA-L的分子质量大小为45.7 ku,最佳表达条件为25℃、0.2 mmol/L IPTG诱导表达5 h,以包涵体形式表达。Western blotting结果表明,重组蛋白ΔGA-L能与MS抗体发生特异性反应。以ΔGA-L抗原包被浓度为0.5μg/mL,一抗稀释度为1∶400,二抗稀释度为1∶12 000为最佳条件,建立了MS抗体间接ELISA检测方法,其阴阳性临界值为0.283;所建立方法特异性强、灵敏度高,有较高稳定性;与商品化MS抗体检测试剂盒总符合率为96%。【结论】本研究成功表达了MS重组蛋白ΔGA-L,所建立的MS抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为MS抗体检测提供了有效快捷的方法。