Detection and Analysis of RXFP2 Gene SNPs Related to Horn Trait of Oula Sheep

Qianglong ZHANG, Sen WU, Cairang DUOJIE, Yanhua TANG, Jie MA

Acta Agric Boreali Sin ›› 2024, Vol. 39 ›› Issue (2) : 200-208. DOI: 10.7668/hbnxb.20194458
Animal Husbandry · Fisheries · Veterinarian

Detection and Analysis of RXFP2 Gene SNPs Related to Horn Trait of Oula Sheep

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Abstract

The aim of this study was to analyze the regulatory effect of RXFP2 gene on horned phenotype and related SNP markers in horned and hornless Oula sheep populations,in order to provide technical support for genetic improvement and breed breeding of Oula sheep.DNA was extracted from 100 ewe blood samples of healthy adult Oula sheep in Henan County,Qinghai Province,including 50 blood samples with horns and 50 blood samples without horns,respectively,15 samples with and without horns were randomly selected for whole genome sequencing,and then all blood samples were amplified by multiple PCR to verify the SNPs of RXFP2 gene.Genome-wide detection results showed that there were strong selection signals in chromosome 10 of Oula sheep,including RXFP2 gene,and the strongest selection signals appeared in the RXFP2 gene segment.Multiple PCR tests verified the accuracy of the 4 coding SNPs screened by whole genome resequencing.Seven high frequency SNPs in the intron region of RXFP2 gene were detected in Oula sheep(29508704G>A,29509428A>C,29509766G>A,29512170G>A,2951276G>A,29514968T>A,29521377C>A).The genotypes of the 7 SNP loci were separated in hornless phenotypes.100% of homozygous genotypes appeared horned or hornless trait,89.66% of heterozygous genotypes were hornless trait and 10.34% were horned trait.The frequency of mutant alleles was less than that of wild alleles,and the population showed an unbalanced state of Hardy-Weinberg,which meant subject to high artificial selection intensity,but the content of polymorphic information was moderate,and the potential of breeding and improvement was still large.In conclusion,the present study confirmed the strong regulatory effect of RXFP2 gene on horn trait in Oula sheep,and filtered out 7 molecular markers of RXFP2 gene on horn trait in Oula sheep population.The relevant results can be used as molecular markers for genetic improvement of the hornless population of Oula sheep.

Key words

Oula sheep / RXFP2 gene / SNPs polymorphic site / Horn trait / Molecular marker

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Qianglong ZHANG , Sen WU , Cairang DUOJIE , Yanhua TANG , Jie MA. Detection and Analysis of RXFP2 Gene SNPs Related to Horn Trait of Oula Sheep. Acta Agriculturae Boreali-Sinica. 2024, 39(2): 200-208 https://doi.org/10.7668/hbnxb.20194458
角是哺乳动物头部表皮和真皮特化所特有的衍生物[1],在对抗天敌、自卫和争夺交配权中有重要作用[2]。随着动物养殖集约化的发展,动物角不仅易对饲养人员及同类造成伤害,还会影响家畜的胴体、毛皮质量,降低饲料转化率,对养殖业造成直接的经济损失,制约了养殖产业的发展。因此,反刍动物无角性状越来越受到人们的关注。
欧拉羊,原名欧拉型藏羊,是在高寒低氧的特殊生态环境中经过长期自然选择和人工繁育而成的地方特色藏绵羊,主要分布在青海高寒牧区。与其他藏羊相比,欧拉羊体形大、四肢高、腰背部宽而平、后躯丰满、肉用生产性能好、生长快[3],可适用于羊肉的工业化生产,具有广阔的市场前景,是肉羊养殖场和专业家庭饲养肉羊的理想品种[4]。
松驰素/胰岛素样肽受体2(Relaxin/insulin-like family peptide receptor 2,RXFP2)又称富含亮氨酸的G蛋白偶联受体8(LGR8),位于绵羊10号染色体,属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族,是胰岛素样因子3(INSL-3)在体内的特异性受体[5]。许多研究表明,RXFP2对羊角性状有显著的影响,也可能影响牛科动物角的发育,其在软质角和角的骨膜中特异性表达,表达量与角的性状和大小呈负相关。Allais-Bonnet等[6]通过对有角和无角90 d胎牛角芽和额头皮肤组织的研究发现,RXFP2参与了牛角芽的分化。赵娟花[7]发现,RXFP2基因在有角牦牛角基组织中mRNA相对表达量显著低于无角牦牛。Wang等[8]的研究也发现,RXFP2基因可能对角发育起重要作用,RXFP2基因在角组织中高表达,并认为RXFP2基因表达降低可能通过减少与配基松弛素的结合,抑制成骨分化和骨质角心的形成[9]。Johnston 等[10]测序研究发现,绵羊10号染色体RXFP2基因的1个SNP位点与角的表型显著相关。Wiedemar等[11]进一步对10号染色体上RXFP2基因进行测序,发现RXFP2基因的3'末端存在一段由插入引起的序列突变,片段长度 1 833 bp,该突变可能影响了RXFP2基因的转录调控,导致无角表型的出现。
本试验以青海省欧拉羊主产区的有角、无角欧拉母羊为对象,研究欧拉羊RXFP2基因多态性位点,并筛选与其有角/无角性状显著相关的SNP位点,以期为无角型欧拉羊的遗传改良提供新的遗传标记位点。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以青海省黄南州河南蒙古族自治县组群建立的纯种欧拉羊群为研究对象,按照标准饲喂流程饲喂。随机选取成年有角型欧拉羊母羊(Pop1)、无角欧拉羊母羊(Pop2)各50只,采用颈静脉采血法,无菌采集各试验动物全血样品10 mL,液氮速冻,随机选取其中各15份样品提取DNA后开展10×深度的基因组重测序,全部血液样本提取DNA后用于开展RXFP2基因区域多重PCR检测。

1.2 基因组DNA的提取

利用血液DNA提取试剂盒(天根生物技术有限公司,北京)提取血样基因组DNA;采用Nanodrop(美国)检测DNA的纯度(OD260/280),琼脂糖电泳检测DNA完整度,多功能酶标仪检测DNA浓度,经检测合格后,置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 欧拉羊群体犄角有无表型调控因子的确定

对无角、有角欧拉羊群体开展全基因组重测序检测分析,并开展Tajima's D、π、Fst选择信号分析,确定欧拉羊群体调控犄角表型的主效基因。

1.4 RXFP2基因SNP位点鉴定

根据NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),GeneBank公布的RXFP2基因的18个外显子序列(NCBI参考序列:NC_056063.1),利用Primer在线软件设计引物,由上海生工生物工程股份有限公司进行合成(引物信息见表1)。设计并合成1个包含RXFP2 基因18个外显子及部分内含子区域的引物池,通过2步PCR方法完成目标SNP位点序列的扩增和兼容Illumina测序文库的制备。第1轮PCR体系如下:DNA 模板(10 ng/μL)2 μL;上游引物池(10 μmol/L)1 μL;下游引物池(10 μmol/L)1 μL;2×PCR Ready Mix 15 μL (总体积 25 μL)(Kapa HiFi Ready Mix)。PCR仪(BIO-RAD,T100TM)反应程序为:98 ℃预变性3 min;然后执行8个循环,条件是98 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;共25个循环,条件是98 ℃变性30 s,66 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s。最后72 ℃延伸5 min。再使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,确定产物大小正确后,使用AMPure XP磁珠纯化回收PCR产物。
Tab.1 Primer information of 18 exons of RXFP2 gene

表1 RXFP2基因18个外显子引物信息

位点
Location		 引物序列(5'—3')
Primer sequences(5'—3')		 长度/bp
Length		 退火温度/℃
Tm
Exon1 F:GGGACTGCAGCTAGTTCACTTT 751 60.3
R:GGCACTTCTATCCATGGCTCTAT
Exon2 F:CATGCACAAGTAGGACAATCACT 743 64.5
R:CAGAAGGAAGTGGTCATCGTTTA
Exon3 F:GCTTTTCCTTCCTTACCATTGTC 597 58.0
R:TCTAGTGGAGCCATGTGAGGTAT
Exon4 F:GCCTTTCTGTGCCATTCAATTA 697 64.5
R:AACCTGGACAATCCAACATACAG
Exon5 F:AAATCACCGTAGATGTTCCAGTC 667 60.3
R:ACCACTCTTCCAGGTTAAAAAGC
Exon6 F:ACTTTGGTGGGTTCAAGTCAGAG 659 58.0
R:TTGCAGCAGGATTCTTTACTACTG
Exon7 F:CCCCAGTGCATTATTTCTGG 738 64.5
R:TGGGGTAGAGACCACAAAGG
Exon8 F:GAGCCCATAATCAGCCAATAAA 842 58.0
R:CTAGAATTTTCAGTGACTCTTGCTG
Exon9 F:GGCTGTATGATGCTGGTAATGA 811 64.5
R:GATAAGAATCCTCCAGCCAATG
Exon10 F:CCATGTCTAAGTGTCAGGCAGA 871 64.5
R:GCAGCAACACTAACCACTTTCA
Exon11 F:CTTTGCTCTTTCTGGCCTTCT 804 60.1
R:CATTCAGCAAACTTCAACTGAG
Exon12-13 F:CCTAAAACAGAGGAAACGAATG 835 60.1
R:TTGTGAGAACCGTAAGATGAGA
Exon14 F:TCAAGCTACAGAGCCAATTTCA 765 62.0
R:CATCTTTCTTCCTAAGGGCTCA
Exon15 F:TATAACACCCCCAGAGAACCAC 825 65.8
R:TAATTTTCTGGGCTTGAGGAAC
Exon16 F:TGTGGGTGTTTTCATTAGTTCG 851 64.5
R:AACTTGGAAGGGTCACAGGAC
Exon17 F:TATCTTTTTGATCTGGCGAACC 842 65.4
R:ACATGGGTTTGATTTCTGGTCT
Exon18 F:TGACTCCAAACCAGAAGATTCC 962 64.5
R:TGCTGCAGAGATAGAGATCCAC
然后以第1轮PCR产物为模板执行第2轮PCR反应,以获得带分子标签的文库用以测序。反应体系如下:DNA模板(10 ng/μL)2 μL,通用P7引物(含分子标签,10 μmol/L)1 μL;通用P5引物(10 μmol/L)1 μL;2×PCR Ready Mix 15 μL(总体积 30 μL)。PCR反应程序为:98 ℃预变性5 min;变性94 ℃ 30 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,5个循环;最终72 ℃延伸5 min。PCR产物纯化回收后,将各个PCR产物等量混合后,使用HiSeq XTen测序仪(Illumina)进行测序。
下机数据通过以下2个步骤进行数据质控:①使用cutadapt(v 1.2.1)软件切除任何含有测序接头序列的部分序列;②使用PRINSEQ-lite(v 0.20.3)软件对剩下的序列进行质控,依照序列的3'端往5'端的顺序,删除质量阈值低于20的碱基。使用BWA(v 0.7.13-r1126)软件将质控合格的序列比对到参考基因组上,参数为默认参数。根据比对结果,通过samtools软件(v0.1.18)计算目标位点的基因型结果,最后Annovar软件对突变位点进行基因注释。

1.5 数据统计与分析

利用SPSS 19.0软件对SNPs位点基因型与角性状进行关联分析,使用卡方检验(Chi-square test)计算相关基因频率、表型频率、基因杂合度、有效等位基因数、哈代温伯格平衡等信息, χ0.052=5.991、 χ0.012=9.21,卡方值大于5.991表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 数据统计与质量检测

经Illumina PE150平台双末端150 bp测序,去除低质量数据,共获得了6 525 104 242个Clean reads。经比对,共有6 473 392 869个Clean reads比对到绵羊基因组上,其中有角欧拉羊为3 213 424 534,无角欧拉羊为3 259 968 335,比对率为99.11%~99.28%。单样本最低测序深度为8.38×,最高为11.38×,满足后续分析要求。
经统计,46只无角欧拉羊DNA样本成功建库检测、48只有角欧拉羊DNA样本成功建库检测,6只欧拉羊样本多重PCR检测建库失败,故后续RXFP2基因SNP检测及后续与欧拉羊犄角表型关联分析基于成功检测的94个样本展开。

2.2 无角、有角欧拉羊群体的Tajima's D选择分析

根据无角、有角欧拉羊群体的基因组SNPs分布,对2个群体开展Tajima' s D选择分析,受该基因Tajima's D强选择信号的Top 10结果见表2。基于Tajima's D选择分析,无角、有角型欧拉羊在NC_019477.2、NC_019484.2、NC_019463.2、NC_019467.2、NC_019460.2、NC_019471.2、NC_019474.2、NC_019458.2等位置存在强选择信号。
Tab.2 Selection analysis of hornless and horned Oula sheep by Tajima's D

表2 无角、有角欧拉羊群体Tajima's D选择分析结果(Top 10)

群体
Group		 染色体
Chromosome		 起始位点
Start site		 SNP数量
SNP number		 Tajima's D检验
Tajima's D test
无角型欧拉羊 NC_019477.2 50280000 160 3.960 54
The hornless Oula sheep NC_019484.2 66800000 226 3.957 48
NC_019463.2 90200000 111 3.932 68
NC_019467.2 42100000 110 3.929 81
NC_019460.2 130080000 194 3.920 43
NC_019484.2 66940000 111 3.905 65
NC_019484.2 66960000 103 3.903 45
NC_019484.2 67060000 62 3.896 94
NC_019471.2 14220000 126 3.887 90
NC_019474.2 58000000 242 3.874 20
有角型欧拉羊 NC_019467.2 32440000 142 3.952 12
The horn Oula sheep NC_019458.2 109560000 152 3.934 47
NC_019484.2 76280000 98 3.928 91
NC_019484.2 84160000 167 3.920 42
NC_019467.2 41860000 82 3.919 64
NC_019458.2 199560000 187 3.905 77
NC_019467.2 41840000 97 3.896 65
NC_019458.2 109580000 183 3.894 97
NC_019467.2 41700000 171 3.887 07

2.3 无角、有角欧拉羊群体的π选择分析

根据无角、有角欧拉羊群体的基因组SNPs分布,对2个群体开展π选择分析,结果见表3。
Tab.3 π selection results of horned and hornless Oula sheep by π

表3 有角、无角欧拉羊群体π选择分析结果(Top 10)

群体
Group		 染色体
Chromosome		 起始位点
Start site		 终止位点
End site		 SNP数量
SNP number		 π值
π value
无角型欧拉羊 NC_019464.2 22640001 22680000 1 281 0.002 218 53
The hornless Oula sheep NC_019475.2 57520001 57560000 1 006 0.002 367 82
NC_019464.2 22620001 22660000 972 0.002 187 53
NC_019464.2 22660001 22700000 989 0.001 798 51
NC_019460.2 205440001 205480000 927 0.001 593 17
NC_019460.2 206780001 206820000 900 0.001 169 72
NC_019458.2 96920001 96960000 836 0.001 220 93
NC_019470.2 36880001 36920000 749 0.001 442 71
NC_019464.2 22560001 22600000 867 0.001 033 39
NC_019460.2 205420001 205460000 837 0.001 196 61
有角型欧拉羊 NC_019464.2 22640001 22680000 1 286 0.011 804 10
The horn Oula sheep NC_019475.2 57520001 57560000 1 003 0.009 558 05
NC_019464.2 22660001 22700000 1 000 0.008 712 36
NC_019464.2 22620001 22660000 966 0.008 669 54
NC_019460.2 205440001 205480000 929 0.008 469 74
NC_019458.2 96920001 96960000 828 0.007 802 66
NC_019460.2 205420001 205460000 835 0.007 780 87
NC_019460.2 206780001 206820000 896 0.007 728 59
NC_019472.2 45640001 45680000 898 0.007 637 26
NC_019470.2 36880001 36920000 726 0.007 569 19
基于π选择分析,发现相较于有角型欧拉羊群体,无角型欧拉羊主要在NC_019464.2(7号染色体)、NC_019475.2(18号染色体)、NC_019460.2(3号染色体)、NC_019458.2(1号染色体)、NC_019470.2(13号染色体)等存在大量SNP突变,存在强选择。

2.4 无角、有角欧拉羊群体的Fst选择分析

Fst选择通过计算2个群体遗传距离,对2个群体分化指数进行计算,对杂合性差异比较,有助于区别2个群体差异性选择区域。有角、无角群体的Fst选择分析结果如表4、图1所示。基于Fst选择分析,发现相较于有角型欧拉羊群体,无角型欧拉羊主要在NC_019467.2(10号染色体)存在大量SNP突变,存在强选择,最强选择信号在NC_019467.2(10号染色体)。而RXFP2基因位于基因组负链29 434 933—29 509 159 bp区域(染色体编号:NC_019467.2),RXFP2基因在有角、无角欧拉羊群体中受到强选择。
Tab.4 Fst selection analysis of horned and hornless Oula sheep by Fst

表4 有角、无角欧拉羊群体Fst选择分析结果

染色体
Chromosome		 起始位点
Start site		 终止位点
End site		 SNP数量
SNP number		 Fst权重值
Fst weighted		 Fst 均值
Fst Mean
NC_019467.2 29420001 29460000 185 0.555 574 0.450 275
NC_019467.2 29440001 29480000 184 0.543 529 0.377 100
NC_019467.2 29340001 29380000 346 0.534 190 0.328 112
NC_019467.2 29400001 29440000 238 0.532 660 0.401 596
NC_019467.2 29360001 29400000 270 0.469 524 0.283 048
NC_019467.2 29380001 29420000 299 0.466 929 0.272 309
NC_019467.2 29320001 29360000 324 0.458 475 0.255 278
NC_019467.2 29460001 29500000 152 0.380 597 0.244 133
NC_019467.2 25440001 25480000 236 0.356 358 0.227 202
NC_019469.2 300001 340000 303 0.336 557 0.209 993
Fig.1 Analysis of Fst selectivity between horn and hornless Oula sheep groups

图1 无角型欧拉羊群体与有角型欧拉羊群体Fst选择性分析

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2.5 欧拉羊RXFP2基因编码区及部分非编码区SNPs扫描

基于全基因组重测序,筛选了4个RXFP2基因编码区高质量SNP;同时,本研究通过多重PCR检测验证了该4个编码区SNP检测的准确性。另外,扫描到部分非编码区SNP,结果如表5所示,在有角、无角欧拉羊群体中,RXFP2基因非编码区共检测到10个内含子位置的突变,其中3个为低频突变(29501199C>T、29501256G>A、29501270A>T),7个为高频突变(29508704G>A、29509428A>C、29509766G>A、29512170G>A、29512176G>A、29514968T>A、29521377C>A)。

2.6 RXFP2基因非编码区SNP与欧拉羊有角、无角表型的关联分析

排除表5中的3种低频突变,对其他高频突变基因型与欧拉羊有角、无角表型进行关联,结果如表6所示,1~7号内含子突变均有3种基因型,各基因型在欧拉羊有角、无角性状上表现出分离;野生型(有角欧拉羊)与突变型(无角欧拉羊)的等位基因频率均为63.30%,36.70%,野生型基因型占优势;野生型纯合子均表现为100%有角、突变型纯合子均表现为100%无角,杂合子中89.66%表现为无角,而10.34%表现为有角;野生纯合子基因型均为47.87%,突变纯合子基因型均为21.28%,杂合基因型均为30.85%。
Tab.5 The SNPs information of RXFP2 intron position

表5 RXFP2基因非编码区部分内含子位置SNP

基因
Gene		 内含子位置
Intron		 突变位置
Variation site		 突变碱基
Alternate		 突变数量
Mutation number		 无角(46)
Hornless number		 有角(48)
Horned number
RXFP2 Intro17 29501199 C>T 1 0 1
RXFP2 Intro17 29501256 G>A 1 1 0
RXFP2 Intro17 29501270 A>T 1 0 1
RXFP2 Intro16 29508704 G>A 74 26 48
RXFP2 Intro16 29509428 A>C 74 26 48
RXFP2 Intro14 29509766 G>A 74 26 48
RXFP2 Intro13 29512170 G>A 74 26 48
RXFP2 Intro13 29512176 G>A 74 26 48
RXFP2 Intro12 29514968 T>A 74 26 48
RXFP2 Intro10 29521377 C>A 74 26 48
Tab.6 The SNPs genotype and its association with the phenotype information of RXFP2 intron

表6 RXFP2基因非编码区内含子SNPs基因型及与表型关联信息

突变位点
Mutation site		 个体数
Number		 基因型(频率/%)
Genotype (frequency)		 表型(频率/%)
Phenotype(frequency)		 等位基因(频率/%)
Alleles (frequency)
29508704G>A 20 GG(21.28) 无角(100) G(36.70)
29 GA(30.85) 无/有角(89.66/10.34) A(63.30)
45 AA(47.87) 有角(100)
29509428A>C 20 AA(21.28) 无角(100) A(36.70)
29 AC(30.85) 无/有角(89.66/10.34) G(63.30)
45 CC(47.87) 有角(100)
29509766G>A 20 GG(21.28) 无角(100) G(36.70)
29 GA(30.85) 无/有角(89.66/10.34) A(63.30)
45 AA(47.87) 有角(100)
29512170G>A 20 GG(21.28) 无角(100) G(36.70)
29 GA(30.85) 无/有角(89.66/10.34) A(63.30)
45 AA(47.87) 有角(100)
29512176G>A 20 GG(21.28) 无角(100) G(36.70)
29 GA(30.85) 无/有角(89.66/10.34) A(63.30)
45 AA(47.87) 有角(100)
29514968T>A 20 TT(21.28) 无角(100) T(36.70)
29 TA(30.85) 无/有角(89.66/10.34) A(63.30)
45 AA(47.87) 有角(100)
29521377C>A 20 CC(21.28) 无角(100) G(36.70)
29 CA(30.85) 无/有角(89.66/10.34) A(63.30)
45 AA(47.87) 有角(100)
由表6,7可知,根据基因型频率分布,经卡方检验,突变型个体实际观测值较理论个体(期望值)大,且卡方检验P值小于0.01,均处于哈代温伯格不平衡状态,说明欧拉羊群体受到强选择,这与欧拉羊群体正处在强人工选择时期的现状相符,欧拉羊群体受到人工选择强度大;在杂合性状方面,欧拉羊群体观测杂合度均低于期望杂合度,说明群体正经历杂合性状分离,杂合优势较低;而有效等位基因数Ne说明,在理想群体中,一个基因座上要获得相同纯合度,需要1.87个等位基因;同时,该7个SNP位点PIC为0.36,处于中度多态,欧拉羊群体仍具有较大遗传潜能,选育潜力较大。
Tab.7 The SNPs polymorphism information of RXFP2 intron

表7 RXFP2基因非编码区内含子SNPs多态信息

突变位点
Mutation site		 个体数
Number		 基因型
Genotype		 理论个体数
Theoretical
number		 卡方值
Chi-square
value		 P值
P value		 多态信息
含量PIC		 观测
杂合度Ho		 期望杂合
度He		 有效等位
基因数Ne
29508704G>A 20 GG 12.66 10.61 0.00 0.36 0.31 0.46 1.87
29 GA 43.68
45 AA 37.66
29509428A>C 20 AA 12.66 10.61 0.00 0.36 0.31 0.46 1.87
29 AC 43.68
45 CC 37.66
29509766G>A 20 GG 12.66 10.61 0.00 0.36 0.31 0.46 1.87
29 GA 43.68
45 AA 37.66
29512170G>A 20 GG 12.66 10.61 0.00 0.36 0.31 0.46 1.87
29 GA 43.68
45 AA 37.66
29512176G>A 20 GG 12.66 10.61 0.00 0.36 0.31 0.46 1.87
29 GA 43.68
45 AA 37.66
29514968T>A 20 TT 12.66 10.61 0.00 0.36 0.31 0.46 1.87
29 TA 43.68
45 AA 37.66
29521377C>A 20 CC 12.66 10.61 0.00 0.36 0.31 0.46 1.87
29 CA 43.68
45 AA 37.66

3 结论与讨论

角是反刍动物的标志性组织,通常反刍动物的角具有共同的基因、细胞和组织起源[8,12]。牛和绵羊角性状具有丰富的表型,如多角表型、无角表型和畸形角等,不同动物角的发生、进化和遗传机制不尽相同,角性状不利于家畜的饲养生产。因此,无角性状作为家畜的有利角型变异在家畜的遗传育种中受到学者们的广泛关注。有研究指出,无角公羊在春、冬季节适应性和体况明显优于有角公羊,较有角公羊能更好地适应当地的生态条件,如滩羊[13],陈青[14]在安徽白山羊和刘梦等[15]在欧拉羊上的研究均证明无角母羊的繁殖性能优于有角母羊,因此,培育无角羊对日后畜牧业的发展具有重要意义。欧拉羊分为有角型和无角型2种,无角型动物比有角型动物性格温顺,攻击性低、生产性能良好,更适合现代集约化养殖,深受当地牧民的喜欢。因此,无角欧拉羊的选育并在该类地区进行规模化养殖具有一定的优势[16]。目前研究已发现,反刍动物的无角性状可能受到多基因、杂合子等的联合影响[11],已成为人们研究的热点。
在有角和无角绵羊中,RXFP2基因被认为是一个强有力的候选基因,可以解释绵羊中角性状的存在与否[17]。进一步对无角绵羊和有角绵羊RXFP2基因3'端PCR扩增试验比较分析,证实在无角绵羊中RXFP2基因3'UTR区域存在一个1.8 kb的插入片段,可能是绵羊的无角性状的致因突变[11]。张磊[18]利用70K SNP芯片对1 920个内蒙古绒山羊个体进行分析,从全基因组水平筛选出在基因组水平筛选RXFP2基因可能是内蒙古绒山羊角性状的重要候选基因。Tian等[19]利用全基因组重测序研究了藏羊的群体遗传结构,筛选并鉴定出4个RXFP2基因上与藏羊角性状相关的SNP位点,即g.29481646 A>G、g.29469024 T>C、g.29462010C>T、g.29461968 C>T。Luan 等[20]利用RNA-seq技术研究了阿勒泰羊105 d胎儿的羊角芽和相邻前额皮肤的差异基因表达谱,发现RXFP2在角芽显著上调表达,功能富集分析发现RXFP2基因可能通过Wnt信号通路参与绵羊胎儿角芽的发育。Lühken等[21]进一步在34个绵羊品种共489个个体中验证这个致因突变,发现这个致因突变和角型性状完全相符。目前,人们已经在陶赛特羊、美利奴羊、小尾寒羊、湖羊、索艾羊、大角羊、阿勒泰羊及7种瑞士绵羊品种中发现RXFP2基因与羊的无角表型及角的长度、方向、畸形等相关[22⇓⇓-25]。绵羊角性状至少由2个位点调控,分别是位于10号染色体的无角位点和位于2号染色体的多角位点[14]。Pan等[22]对89个中国绵羊的重测序分析发现RXFP基因与绵羊的半野化相关,且与角长和角生长方向相关,RXFP2基因可能是与绵羊无角表型与正常角长度和粗细的数量性状相关的候选基因之一。张磊[18]还通过候选基因位点的Sanger测序和分型统计发现RXFP2基因57445295位点A→C的突变与内蒙古绒山羊的角间距性状显著相关,可能是角间距调控的主要位点之一。Allais-Bonnet等[6]发现,有角和无角表型的角芽组织中RXFP2基因存在显著差异,无角表型胎儿角芽部位RXFP2表达量显著低于有角表型(P<0.05)。赵娟花等[2]研究发现,RXFP2基因在有角牛(表达量低)和无角牛(表达量高)中表达量差异显著。研究还报道,RXFP2基因可能在绵羊、山羊胚胎发育早期通过影响神经、骨骼等发育,影响了反刍动物出生后犄角的生成及角型表达,是绵羊山羊犄角发育和角型表达的核心调控基因[6,22,26]。本研究初步猜想,RXFP2也可能为调控欧拉羊犄角发育的核心基因,然而目前有关RXFP2基因与欧拉羊群体角性状的研究未见报道。
为探究RXFP2基因在欧拉羊群体中的选择效应,本研究对纯种无角、有角欧拉羊进行了10×全基因组测序,分别通过对无角、有角欧拉羊群体中基因SNPs受选择情况进行了Tajima's D、π、Fst选择分析,发现在NC_019467.2(10号染色体)存在包含RXFP2基因在内的强选择信号,证实了欧拉羊群体无角性状受到RXFP2基因的强烈选择。在团队前期的研究中,通过全基因组重测序检测到欧拉羊RXFP2编码区存在4个高质量SNP可能与欧拉羊犄角有无表型有关;而本研究通过对RXFP2编码区及部分非编码区的多重PCR扩增检测,在验证前期编码区突变SNP的同时,还检测到10个非编码区SNP;除去3个低频SNP外,7个内含子区域SNP的对应基因型在欧拉羊有角、无角群体中表现出性状分离,野生纯合基因型100%表现为有角、突变纯合型100%表现为无角,但杂合基因型中有89.66%表现为无角,10.34%表现为有角。RXFP2基因SNP中杂合基因型未一致表现出犄角有无表型,说明了RXFP2基因是反刍动物(欧拉羊)犄角发育的主效控制基因,但不是唯一调控基因。在Wang等[8]研究中,反刍动物胚胎时期头犄角芽部神经嵴细胞的细胞分化决定了反刍动物犄角的有无及犄角发育,而RXFP2基因同时影响了神经嵴细胞分化的5种调控过程,是决定牛羊等有犄角反刍动物犄角发育的最核心基因,其他HOXD、FOXD3、SOX9、SOX10等基因也参与了细胞分化的部分调控过程。本研究中,虽然同样在欧拉羊RXFP2基因部分内含子区域检测到7种高频SNP,且内含子的SNP纯合子在有角、无角表型上表现出分离,但由于内含子不编码蛋白,在基因mRNA成熟过程中会被自然剪切掉,且业内对内含子调控功能研究尚未明确,具体功能需要进一步探索。然而,欧拉羊RXFP2 SNP纯合基因型完全表现出对犄角表型的调控作用,而杂合基因型不完全表现为无角或有角,也间接证实绵羊犄角表型表达在主要受RXFP2基因调控的同时,还可能受其他基因调控作用的影响,但具体机理还需进一步试验探索验证。
本研究针对无角型欧拉羊、有角型欧拉羊群体开展了基因组选择研究,研究结果确定相对于有角型欧拉羊群体,无角欧拉羊群体中RXFP2基因受到强选择,是有角、无角欧拉羊群体犄角有无表型的主要调控基因,验证了RXFP2基因编码区存在4个SNP,检测到RXFP2基因非编码区7个SNP,且该7个SNP不同基因型在犄角有无表型上存在分离,该结果可用作欧拉羊犄角有无表型的分子标记,用于无角欧拉羊品种培育过程中的早期分子选种,同时为后期进一步深入开展无角欧拉羊表型调控机理机制研究奠定基础。

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