Isolation and Genome-wide Evolutionary Analysis of Novel Variant Porcine parvovirus Type 1 in Shandong Province

Yongle YU, Yanzhu YAO, Ruihua ZHANG, Chao CHEN, Ting ZHAO, Hu SHAN, Xianjie HAN

Acta Agric Boreali Sin ›› 2023, Vol. 38 ›› Issue (1) : 232-238. DOI: 10.7668/hbnxb.20193540
Animal Husbandry·Fisheries·Veterinarian

Isolation and Genome-wide Evolutionary Analysis of Novel Variant Porcine parvovirus Type 1 in Shandong Province

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Abstract

It conducted to analyze the biological characteristics of Porcine parvovirus type 1 (PPV1) mutant strains.The PPV was isolated and cultured from 67 aborted fetal tissue samples collected from pig farms in different regions of Shandong Province,and identified by electron microscopy and IFA test.DNAMAN V6 was used to demonstrate and compare the secondary structures of 5'UTR and 3'UTR,MEGA V7 was used for genetic evolutionary analysis,and finally the multi-step growth curve was used to compare the proliferation ability of the isolates in susceptible cells.Three strains were isolated and identified as PPV type 1 strains,named SDPV1,SDPV2 and SDPV3,with GenBank accession numbers ON924737,ON924738 and ON924739,respectively;the whole gene sequence lengths of the three isolates were basically the same,among which the 5'-UTR sequence was highly conserved and had a Y-shaped structure,while the 3' UTR had a U-shaped structure with some differences in individual bases;there were five non-synonymous mutation sites in the amino acid sequence of VP2,namely T20A,R82K,Q226E,D366N and K407N,which were found for the first time in domestic strains.The growth curve showed that the mutant strain had a relatively fast growth trend,with a 10-fold difference in the highest titer compared with the PPV-QN strain.It reported the genomic characteristics of PPV strains containing novel mutant loci.

Key words

Porcine parvovirus type 1 / Mutant strain / Whole genome / Genetic variation

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Yongle YU , Yanzhu YAO , Ruihua ZHANG , Chao CHEN , Ting ZHAO , Hu SHAN , Xianjie HAN. Isolation and Genome-wide Evolutionary Analysis of Novel Variant Porcine parvovirus Type 1 in Shandong Province. Acta Agriculturae Boreali-Sinica. 2023, 38(1): 232-238 https://doi.org/10.7668/hbnxb.20193540
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍疾病的重要病原之一,临床上以产死胎、木乃伊胎、弱仔和不育等症状为主要特征[1]。PPV于1965年在德国从猪流产胎儿中首次被成功分离出来,被命名为PPV1,随后在全世界多个国家均有报道[2]。近年来,PPV1的大规模感染和快速流行导致母猪的繁殖能力显著下降,严重阻碍了全球养猪业的健康发展,并造成了巨大的经济损失[3]。
PPV属于细小病毒科,细小病毒亚科,原细小病毒属成员,病毒粒子无囊膜,直径为25 nm,正二十面体对称,其基因组为单股负链 DNA(ssDNA),大小约5 kb[4],在基因组的末端存在2个较长的反向末端重复序列(ITR),这些序列分别组装成不同形状的发夹结构,5'ITR为Y型结构,3'ITR为U型结构,在病毒复制过程中发挥重要作用[5⇓-7];基因组CDS区包含2个大的开放阅读框 (ORF),ORF1编码非结构蛋白NS1、NS2和NS3,ORF2编码结构蛋白VP1、VP2 和VP3。其中,NS蛋白是基因组复制的调控蛋白,具有多个复制相关区域,例如,DNA 结合区域、ATP 结合区域、解旋酶结构域和反式激活结构域等,此外,NS蛋白对宿主细胞具有细胞毒性,并且是细胞凋亡的重要诱因[8⇓-10]。VP1 和 VP2是同一基因选择性剪接的结果,而 VP3 是通过VP2蛋白水解切割形成的。这些结构蛋白主要与病毒吸附和进入宿主细胞、细胞内运输和定位、病毒释放以及诱导免疫反应密切相关[11⇓⇓-14]。
近年来,通过宏基因组测序陆续发现了6种不同基因型的PPV,分别为PPV2~PPV7,且在我国均有分布[15],目前,国内外对新型PPV2~PPV7变异株研究日益增多,而对经典PPV1型毒株的遗传变异关注较少。山东省作为养猪大省,规模化猪场PPV1感染呈上升趋势 [16⇓⇓-19],亟须加强PPV1流行毒株特性及基因组演化研究。为了解山东猪场PPV1的基因组变异情况,本研究针对仔猪样品中PPV阳性病料进行病毒分离鉴定和全基因组扩增,并对基因组序列变异位点进行详细比较分析,为研究PPV遗传变异规律和制定有效防控策略提供参考。

1 材料和方法

1.1 细胞、毒株及主要试剂

PPV-QN株病毒由山东省预防兽医学重点实验室分离、培养和保存;猪肾细胞系(PK-15)、兔抗PPV-VP2多克隆抗体由本实验室制备,纯化和保存。
DMEM高糖细胞培养基(含GlutaMAXTM添加剂)、胰蛋白酶均为Gibico产品;特级胎牛血清购自Biological Industries公司;DNA病毒基因组提取试剂盒(D2400)、D2000 DNA Ladder、10000×SolarRed 核酸染料、JM109感受态细胞、T4 DNA连接酶、pUC18质粒载体均购自北京索莱宝科技有限公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、MiniBEST DNA凝胶回收试剂盒、MidiBEST无内毒素质粒中提试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司;0.22 μm滤器购自Millipore公司;FITC标记的山羊抗兔IgG (H&L) 购自Biovision公司。

1.2 病料采集和处理

采集的病料为来自山东青岛、日照和烟台养猪场流产和死亡胎儿的肺、肝、扁桃体、心脏和肾脏样品,共计67份。
充分研磨后,加入等比例灭菌PBS缓冲液颠倒混匀,10 000 r/min离心5 min,取上清液用DNA病毒基因组提取试剂盒提取DNA。PPV的检测参照邹敏等[20]建立的猪细小病毒PCR检测方法进行。

1.3 病毒分离

PPV阳性上清液通过0.22 μm细菌滤器过滤,待细胞传代时,将滤液按照1/10体积加入PK-15细胞培养液中,置于37 ℃培养箱,5% CO2条件下进行病毒分离。当80%细胞出现CPE后,三冻三融,无菌收集冻融细胞悬液,然后继续接种至新的PK-15细胞,盲传3~4次至CPE稳定出现。最后对收获的细胞悬液进行PCR检测以确认分离成功,并储存在-80 ℃冰箱备用。

1.4 电镜观察

对于透射电子显微镜检查,首先收获PPV感染的PK-15细胞培养液,在4 ℃下以 8 500 r/min离心20 min去除杂质,将上清液覆盖在60%蔗糖溶液上,然后在4 ℃下30 000 r/min超速离心3 h以获得病毒蔗糖溶液。病毒蔗糖溶液在PBS中稀释,在4 ℃下30 000 r/min离心2 h,收集病毒颗粒。将病毒颗粒重悬于PBS中并用铜网均匀覆盖。用2%磷钨酸染色 2 min后,在60 ℃下烘烤15 min后进行观察。

1.5 间接免疫荧光(IFA)

为了进行免疫荧光测定,将96孔板中培养的PK-15细胞接种PPV病毒,感染复数MOI为 1 PFU。感染48 h后,将细胞在室温下用3%多聚甲醛固定15 min,然后在室温下加入含1% TritonX-100 PBS一起孵育。随后将细胞与本实验室自行制备的多抗(针对 PPV VP2蛋白的多克隆抗体)孵育1 h,然后与 1∶2 000 稀释的FITC标记的山羊抗兔 IgG(H+L)二抗孵育1 h。使用Lecia DM 500荧光显微镜进行观察。

1.6 多步生长曲线的绘制

将分离株以MOI=0.1的接种量感染PK-15细胞,在感染后间隔12 h收获1次病毒,连续96 h测定各时间点病毒滴度(TCID50),利用GraphPad Prism绘制多步生长曲线。

1.7 全基因扩增引物设计与合成

对于全基因组扩增,设计7对引物(表1)用于对覆盖病毒整个基因组的7个片段进行PCR 扩增。引物序列由青岛志远生物工程有限公司合成,序列信息详见表1。
Tab.1 Information of primer sequences

表1 引物序列信息

序号
No.		 引物
Primer		 引物序列(5'—3')
Primer sequence(5'—3')		 片段大小/bp
Fragment size
1 Y1 F:AATCTTTAAACTGACCAACT 90
R: ATGGTGACGTGTGACTGCCG
2 Y2 F: CTTCGGCAGTCACACGTCACCA 321
R: TAAATACATAAGAGAATGC
3 C1 F: GGCTTCAAGATAATGCTCAA 1 900
R: CAGGCTCTTATGTCGGTTTCTA
4 C2 F: ACAATGCAGCCAATGTGAACT 1 879
R: ATTGAGTTGGTTTTGTAGGTA
5 C3 F: TCTGCAACAGGAAATGAATC 1 967
R: GACATAAGGTCATATAAGTGTG
6 U1 F: AACCTAGACTACATGTTACAGC 674
R: AGAGCCGCTTGGTTAGTCG
7 U2 F: GTATTCCTTTGAGTTAGTTG 158
R: AACTAAACCAACCACACTTA

1.8 全基因组扩增、克隆及序列测定

PPV基因组中间序列(C1/C2/C3)PCR反应体系:2×PrimeSTAR Max 25 μL,上游引物(10 μmol/L) 1 μL,下游引物(10 μmol/L) 1 μL,Viral DNA 1 μL,ddH2O补充至50 μL;PCR反应条件:98 ℃变性 5 min;98 ℃ 10 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,共30个循环;72 ℃终延伸10 min。
由于PPV基因组3'和5'末端序列分别存在复杂的发夹结构,普通PCR程序无法获得完整的发夹序列,本研究采用高保真酶PrimeStar HS DNA polymerase以及优化的PCR反应程序进行扩增,PCR反应体系:PrimeStar HS Polymerase 2 μL,2×GC Buffer 25 μL,上游引物(10 μmol/L) 2 μL,下游引物(10 μmol/L)2 μL,dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL,Viral DNA(0.5 ng/μL) 4 μL,ddH2O补充至50 μL;PCR反应条件:98 ℃变性5 min;98 ℃ 10 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,共32个循环;72 ℃终延伸10 min。

1.9 序列比对分析、拼接及进化分析

使用SnapGene V4编辑和组装病毒基因组的整个序列;利用DNAMAN V6 对PPV基因组末端5'ITR和3'ITR二级结构进行展示和比较;应用MEGA V7软件通过邻接法重建系统发育树。Bootstrap值由1 000次重复数据集确定,并生成进化树。各参考毒株信息见表2。
Tab.2 The background of reference strains

表2 参考毒株信息

毒株
Strain		 基因登录号
GenBank No.		 收集时间
Collection
date		 国家
Country
BQ EU790641 2006 中国
Taian FJ853421 2008 中国
HN-2011 JX992846 2008 中国
GD2013 KX242359 2013 中国
HNLY201301 MF447833 2013 中国
SDQD20200424-830 MZ577027 2020 中国
JSYZ20170418-30 MZ577026 2017 中国
DJH23 MK092383 2015 中国
HuN 1 MH183298 2015 中国
China-XY MK993540 2017 中国
PPV2010 JN872448 2010 中国
1242-2012 MH558678 2012 意大利
J-PPV KF742500 2013 中国
27a AY684871 2004 德国
15425 JN400520 2011 德国
Kresse U44978 1996 加拿大
NADL-2 KF913345 2012 匈牙利

2 结果与分析

2.1 PPV突变株分离及鉴定

由图1可知,将PPV阳性样本接种到PK-15细胞上,成功分离出3株病毒,分别命名为SDPV1、SDPV2和SDPV3。与正常的PK-15细胞相比,受感染的细胞皱缩、变圆、裂解(图1-A)。电子显微镜显示存在许多直径约20 nm的正二十面体无包膜病毒颗粒(图1-B)。使用针对PPV-1VP2蛋白的多抗进一步进行免疫学分析,由此观察到VP2蛋白在感染细胞中高度表达(图1-C)。这些结果表明,新分离的病毒属于PPV1型。
Fig.1 Isolation and identification of PPV strains
A.CPE(100×);B.PPV viron(50 000×);C.Results of IFA test(100×).

图1 PPV突变株分离及鉴定

A.细胞病变(100×);B.PPV 病毒粒子(50 000×);C.间接免疫荧光结果(100×)。

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2.2 全基因组扩增与序列分析

为了研究分离株的基因组特征,使用一组特异性引物获得了分离株SDPV1、SDPV2和SDPV3的完整基因组,扩增结果见图2。分离株的全基因组序列具体信息如表3所示。3个分离株全基因序列长度基本一致,经DNAMAN V6对二级结构进行展示,所有毒株5'-UTR发夹结构完全一致,呈Y型,长约120 bp,内部包含2个小的回文序列;而3'-UTR发夹结构呈U型,长约220 bp或222 bp,发夹双链互补区存在一个小的“bubble”结构。与Kresse株的U型发夹序列相比,SDPV1与SDPV3有一个碱基对的突变(A→T);SDPV2有一个碱基对 (GC) 的插入(图3)。
Fig.2 Whole genome amplification results of PPV isolates

图2 PPV分离株全基因组扩增结果

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Tab.3 The genome sequences of three PPV isolates

表3 分离株全基因组序列信息

毒株
Strain		 基因登录号
GenBank No.		 基因组大小/bp
Genome		 5'-UTR 3'-UTR NS1 NS2 NS3 VP1 VP2
SDPV1 ON924737 5 076 291 527 1 989 486 324 2 190 1 740
SDPV2 ON924738 5 078 291 529 1 989 486 324 2 190 1 740
SDPV3 ON924739 5 076 291 527 1 989 486 324 2 190 1 740
Fig.3 Secondary structures of palindromic terminal repeats of PPV
A.Left-end hairpins of PPV;B.Right-end hairpins of PPV;Black arrows.Structural changes.

图3 PPV末端重复序列的二级结构

A.PPV左侧发夹结构;B.PPV右侧发夹结构;黑色箭头.结构差异。

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此外,使用MegAlign对PPV毒株VP2蛋白氨基酸序列进行分析,第378,383位以及436位氨基酸位点与强毒株Kresse株是一致的;此次分离株VP2氨基酸序列中有5个非同义突变位点,分别为T20A、R82K、Q226E、D366N和K407N等(表4)。与国内毒株相比,上述氨基酸突变尚未见报道。
Tab.4 Amino acid sequence variations in the VP2 of three PPV strains

表4 分离株VP2蛋白氨基酸序列中非同义突变位点

PPV毒株
PPV isolate		 VP2
20 82 144 226 228 320 366 378 383 407 414 419 436 565
SDPV1 A R A E Q T D G Q K A Q S K
SDPV2 T K A Q Q T D G Q N A Q S K
SDPV3 T K A Q Q T N G Q K A Q S K
BQ T R E Q Q I D G Q K A E P K
Taian T R E Q Q I D D H K A E S R
HN-2011 T R A Q Q T D D Q K A E S R
GD2013 T R E Q Q I D D H K A E S R
HNLY201301 T R A Q Q T D G Q K A E S R
SDQD20200424-830 T R A Q Q T D G Q K A E S R
JSYZ20170418-30 T R E Q Q T D G Q K A E P K
DJH23 T R E Q E I D G Q K S Q T K
HuN1 T R E Q E I D G Q K S Q T K
China-XY T R E Q Q S D D H K A E S R
27a T R E Q E I D G Q K S Q T K
15425 A K E E Q T N G Q N A E P K
Kresse T R E Q Q I D G Q K A E P K
NADL-2 T R E Q Q I D D H K A E S R

2.3 突变株生长曲线比较

如图4所示,突变株生长趋势相对较快,感染至48 h达到最大病毒滴度10-6.5 TCID50/mL,与PPV-QN株相比,最高滴度相差10倍,表明突变株病毒复制水平升高。
Fig.4 Multi-step growth curves of PPV isolates

图4 各突变株多步生长曲线

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2.4 遗传进化分析结果

由图5可知,本研究3个分离株聚集形成一个小的分支,与山东青岛分离株QD20200424-830和河南洛阳分离株HNLY201301聚类关系较近,而与参考毒株Kresse以及NADL-2相对较远。总体而言,国内分离株亲缘关系较近,可能具有相同的起源。
Fig.5 Phylogenetic analysis based on genome sequences of PPV1 strains
A.Whole genome sequences;B.VP2 sequences.

图5 PPV1分离株基因组进化分析

A.全基因组序列分析;B.VP2基因序列分析。

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3 结论与讨论

PPV1被认为是导致猪繁殖障碍的最重要原因之一。众所周知,PPV1对我国养猪业造成经济损失已超过20 a。然而,随着PPV新的基因型不断出现,目前大多数研究集中在PPV2-7型,很少有研究关注PPV1的存在。因此,对于当前PPV1的流行情况以及基因组遗传变异情况了解较少。
本研究从2020—2021年山东省不同地区猪场中分离到3株PPV 1毒株,并对其全基因组进行测序。利用DNAMAN软件,预测其二级结构发现,所有毒株5'-UTR Y型发夹结构完全一致,高度保守;而3'-UTR U型发夹结构与Kresse株相比,有一个碱基对的突变(A→T)和一个碱基对 (GC) 的插入。以上发夹序列碱基的突变和插入严重影响序列结构的最小自由能,可能会导致发夹结构构象以及稳定性发生改变,进而影响病毒的生物学特性。本研究成功克隆了5'-和 3'-发夹结构序列,可为进一步构建PPV全基因组克隆提供支持[21]。
PPV衣壳蛋白VP2中仅少数几个氨基酸残基的取代是造成不同生物学特性的原因。尽管细小病毒序列具有高水平的保守性,但PPV毒株可以通过其不同的致病性来区分。Thr-45-Ser、Ile-215-Thr、Asp-378-Gly、His-383-Gln、Ser-436-Pro 和 Arg-565-Lys这些替换是导致强毒株Kresse与减毒株NADL-2毒力差异的重要位点[22];378,383,565位氨基酸还可能参与免疫反应,是关键的抗原性相关位点[3]。本研究3个分离株除了包含与上述相似的氨基酸替换以外,还有5个新的非同义突变位点,分别为T20A、R82K、Q226E、D366N和K407N,均为国内毒株首次报道。从生长曲线分析,新的突变在一定程度上提高了病毒的复制及增殖能力。
PPV1 对环境抵抗能力很强,猪场一旦感染很难清除,而且特别容易与PRRSV等病原混合感染。祖立闯等[23]针对PPV1的流调显示,PPV1在我国呈现散发性、区域性流行,其感染情况不容乐观。徐富权等[24]证实四川地区PPV1毒株与湖南地区的HuN1毒株和吉林长春的DJH24毒株同源性较高,证明此毒株在我国西南、中部、东北地区广泛传播,且并未进行较大程度的变异。最近,郑艺等[25]报道了PPV1河南分离株HNLY201301具有很强的致病性,因此对该病的防控应引起足够重视。总之,本研究分离到的3株PPV1变异株,全基因测序显示其3'-UTR发夹结构序列和VP2蛋白氨基酸序列与国内分离株差异较大,本试验数据为鉴定PPV1新型突变体提供了具体证据,为进一步监测新型 PPV1变异株的流行奠定了基础。

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