Analysis of Flavonoid Metabolism in Different Cultivated Pepino Fruits Based on Transcriptome and Metabolome

Cheng SI, Shipeng YANG, Zhu SUN, Guangnan ZHANG, Qiwen ZHONG

Acta Agric Boreali Sin ›› 2023, Vol. 38 ›› Issue (1) : 53-62. DOI: 10.7668/hbnxb.20193361
Crop Genetics & Breeding·Germplasm Resources·Biotechnology

Analysis of Flavonoid Metabolism in Different Cultivated Pepino Fruits Based on Transcriptome and Metabolome

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Abstract

In order to understand the main flavonoids and the key synthase genes related to flavonoids and clarify the differences of flavonoids among different pepino.Combined metabolomic and transcriptomic analyses were carried out with the mature pepino(LOF and SRF)currently main cultivars in China.The results showed that 9 kinds of secondary metabolites and 41 kinds of tertiary metabolites were identified,and the flavonols content was the highest.There were 21 metabolites with significant differences in flavonoid components,which were distributed in 6 secondary metabolites such as flavanols,flavonoid carbonoside.The total content of dihydroflavonol,flavanols and isoflavones was higher in the Light-oval fruit(LOF)than in the Sweet-round fruit(SRF),while other compounds including flavonols were higher in the SRF.A total of 503 genes related to flavonoid synthesis were identified by RNA-seq analysis,the expression of Phenylalanine ammonia-lyase(PAL),Cinnamyl alcohol dehydrogenase(CAD),and Flavanone-3-Hydroxylase(F3H)which were key genes for upstream stage of the whole process of pepino flavonoid synthesis,were all up-regulated in LOF compared to SRF.Flavonol synthase gene expression was consistently higher in SRF than LOF.According to the result of transcriptome,the expressed trend of 4 flavonoid synthases agreed with the testing by the RT-PCR.The results showed that a large number of flavonoid compounds and their synthase genes were present in different cultivars of pepino.However,the content of different flavonoid components and the activities of enzymes related to its assimilation and is varied among different resources.

Key words

Pepino / Flavonoids / Transcriptome / Metabolome

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Cheng SI , Shipeng YANG , Zhu SUN , Guangnan ZHANG , Qiwen ZHONG. Analysis of Flavonoid Metabolism in Different Cultivated Pepino Fruits Based on Transcriptome and Metabolome. Acta Agriculturae Boreali-Sinica. 2023, 38(1): 53-62 https://doi.org/10.7668/hbnxb.20193361
香瓜茄(Solanum muricatum)又名人参果,属茄科茄属多年生草本植物,起源于南美洲安第斯山脉[1]。其果实通常呈圆形、椭圆形或细长形,黄色果皮上常覆盖紫色条纹,香气浓郁,果肉黄色多汁有甜味。含水量高,热量低[2],有丰富的钾、维生素、钙和硒等多种营养物质。但在很长一段时间内,香瓜茄仅被作为一种次要水果[3]。近几年的研究发现,香瓜茄由于其特殊的口感以及在抗氧化、抗炎症、抗糖尿病及抗肿瘤等保健功能开发方面具有很大的潜力[4-5],而受到广泛关注,在我国云南、甘肃及青海等地种植面积逐年扩大。
类黄酮作为广泛分布在植物中的一大类化合物,具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等广泛的生理及药理活性。在苹果、番茄和西蓝花等园艺作物中广泛富集且多有研究[6-7]。伴随着食品营养研究手段的不断深入,香瓜茄中含有的抗氧化物质得以逐步发现[7-8]。研究表明,香瓜茄果实中含有大量的类黄酮和酚类化合物,尤其是芦丁、没食子酸及抗坏血酸等[9]。香瓜茄抗自由基、降低胆固醇等特性均和类黄酮化合物有关[10],高自由基清除活性表现出良好的抗氧化活性,并具有预防氧化应激潜力[11],有助于花色形成和紫外线防护[12]。
了解香瓜茄果实类黄酮物质等重要品质性状形成关键组分及其分子调控机制,是开展品质育种工作的基础。而目前此类研究报道较少,仅针对未成熟和成熟果实进行了比较[13],其具体组分及含量不明确,关键调控基因尚不明晰。因此,本研究拟以国内主栽的2个香瓜茄栽培种为研究对象,利用代谢组联合转录组进行系统分析,以明晰香瓜茄果实中类黄酮物质的主要组分,主要香瓜茄栽培种之间类黄酮物质的各组分含量以及关键调控基因的表达差异,以期为香瓜茄品质改良提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究以香瓜茄甜圆形果实类型(Sweet-round friut,SRF)和淡椭圆形果实类型(Light-oval fruit,LOF)2个香瓜茄栽培种为材料,分别为中国云南等南方地区露天栽培和甘肃、青海等北方地区设施栽培的主要栽培种。试验材料种植于青海大学农林科学院园艺试验基地(36°38'N,101°55'E,海拔2 200 m)。SRF果实单果质量为50~90 g,果皮较薄,有类似甜瓜和黄瓜的香味;LOF单果质量为150~300 g,果皮较厚,香气较SRF清淡,口感多汁。果实成熟的信号“紫色条纹”充分显现并且果实表皮变黄、颜色一致时采摘,液氮冷冻后进行样品前处理。

1.2 试验方法

1.2.1 代谢组学分析

样品提取:取2个栽培种香瓜茄各3个生物学重复进行代谢组学分析。真空冷冻干燥生物样品;研磨仪(MM 400,Retsch)30 Hz研磨样品1.5 min至粉末状;称100 mg粉末溶于0.6 mL提取液中;样品溶解液4 ℃冰箱冷藏过夜,其间涡旋6次以提高提取率;12 000 r/min离心10 min后吸取上清,微孔滤膜(0.22 μm 孔径)过滤后保存于进样瓶,用于UPLC-MS/MS分析。
液相条件主要包括:色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm,2.1 mm×100 mm;流动相:A相为超纯水(加入0.04%的乙酸),B相为乙腈(加入0.04%的乙酸);洗脱梯度:0.00 min B相比例为5%,10.00 min内B相比例线性增加到95%,并维持在95% 1 min,10.00~11.10 min,B相比例降为5%,以5%平衡至14 min;流速0.35 mL/min;柱温40 ℃;进样量4 μL。
质谱条件主要包括:电喷雾离子源(Electrospray ionization,ESI)质谱电压5 500 V,温度550 ℃,帘气(Curtain gas,CUR)30 psi,碰撞诱导电离(Collision-activated dissociation,CAD)参数设置为高。三重四级杆(QQQ)中,每个离子对根据优化的去簇电压(Declustering potential,DP)和碰撞能(Collision energy,CE)进行扫描检测。
数据质控:质控样本(QC)用混样进行仪器分析,每10个检测分析样本插入1个质控样本,以监测分析过程的重复性。
标准品检测:利用本地代谢数据库对样本代谢物进行质谱定性定量分析。多反应监测模式MRM代谢物检测多峰图检测样品中的物质。利用三重四级杆筛选每个物质的特征离子,通过检测器获得特征离子的信号强度(CPS),下机质谱文件进行色谱峰的积分和校正,每个色谱峰的峰面积(Area)代表对应物质的相对含量。根据代谢物保留时间与峰型的信息,对每个代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行校正。

1.2.2 转录组学分析

RNA提取及检测:采用TRIzol法提取2个栽培种香瓜茄果实样本各3次重复,采用琼脂糖凝胶电泳、NanoPhotometer分光光度计、Qubit 2.0荧光计、Agilent 2100生物分析仪分析RNA的完整性、DNA污染、纯度、浓度及完整性。
cDNA文库的构建:mRNA的获取主要有2种方式:一是真核生物mRNA大部分都带有polyA尾,利用Oligo(dT)磁珠富集有polyA尾的mRNA;二是从总RNA中除去核糖体RNA得到mRNA。得到mRNA后加入Fragmentation Buffer将RNA打断成短片段作为模板,用六碱基随机引物(Random hexamers)合成第一链cDNA,然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase Ⅰ合成二链cDNA,AMPure XP beads纯化双链cDNA、末端修复、加A尾并连接测序接头。然后用AMPure XP beads选择片段大小后进行PCR富集得到最终cDNA文库。
文库质检:构建完成的文库进行质量检测,Qubit 2.0初步定量后,Agilent 2100检测文库的Insert size是否符合预期,最后,Q-PCR方法准确定量文库有效浓度(有效浓度>2 nmol/L)后,完成库检。
上机测序:库检合格后,按照目标下机数据量进行pooling,用Illumina HiSeq平台进行测序。

1.2.3 差异表达基因qRT-PCR分析

根据转录组测序得到的FPKM值,选取不同香瓜茄资源中差异表达的4个参与类黄酮合成的基因进行qRT-PCR。RNA检测OD值、判定RNA纯度。合格的RNA采用Aidlab公司反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit)进行反转录,4个参与类黄酮合成的酶基因引物合成如表1。
Tab.1 The qRT-PCR primers for the 4 selected genes

表1 荧光定量PCR分析的4个基因的引物

编码ID
Code ID		 基因名称
Gene name		 引物序列(5'—3') Primer sequences
F R
Cluster-1244.24547 PAL TGAAATCGCTATGGCCTCGT TTTCAATATGTCAACTGCCTCC
Cluster-1244.48177 PAL TGATGTTTGCACAATTCTCC TTTGCCAAGAATTGAAGCTC
Cluster-1244.48397 F3H CAACTATTTTGCCTGCTTC GTATTCTTCACATGCCTCC
Cluster-1244.16099 FLS TTACACTAGGATTGCCACCAC TCTGCCATTGTTTTCATCTCG
Cluster-1244.3348 CAD GATTCCTACATACAACGGCTA AGTAATTCCAGCACATAACAGG
Cluster-2666.0 CAD GCTACTCGGACATAATTGTTG TTGTAATTCCAGCACAAAGCA
内参基因Actin GAACCGGAGCAGGTGAAGAA GAAGCAATCCCAGCGATACG

1.2.4 数据处理

利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据;代谢物含量数据通过R软件(www.r-project.org/)进行归一化处理。转录组组装、转录本聚类、CDS预测、差异表达分析、转录因子分析分别采用Trinity(2.6.6)、Corset(1.07)、TransDecoder(5.3.0)、DESeq2、iTAK(1.7a)等软件。代谢组及转录组数据利用Excel进行筛选。火山图、KEGG、GO分析等利用R作图。

2 结果与分析

2.1 代谢组分析香瓜茄果实代谢产物与类黄酮主要组分含量差异

基于UPLC-MS/MS检测平台和数据库,利用广泛靶向代谢组分析香瓜茄2个栽培种的6个样本,检测到的代谢物共402个。其中酚酸、脂质、氨基酸及其衍生物、生物碱、类黄酮等次生代谢产物种类丰富,分别有70,68,60,44,41种,其中核苷酸及其衍生物、醌类、类黄酮、萜类等含量在2个栽培种中存在明显差异,核苷酸及其衍生物、萜类物质在LOF中含量高于SRF,类黄酮和醌类物质含量则相反。其中醌类和萜类物质相较于类黄酮物质种类较少(表2)。
Tab.2 Specific composition,quantity and content of different metabolites in SRF and LOF of pepino sativus cultivars

表2 不同香瓜茄栽培种果实中不同代谢产物具体成分、数量及含量

一级代谢产物
Primary metabolites		 数量
Quantity		 相对含量 Relative content
LOF SRF
氨基酸及其衍生物 Amino acid and its derivatives 60 3.20E+08 2.34E+08
酚酸类 Phenolic acids 70 3.76E+08 4.33E+08
核苷酸及其衍生物 Nucleotide and its derivates 34 1.67E+08 8.58E+07
类黄酮 Flavonoids 41 1.15E+07 3.06E+07
醌类 Quinones 1 6.14E+03 3.62E+05
木脂素和香豆素 Lignans and coumarins 12 4.06E+06 2.65E+07
生物碱 Alkaloids 44 2.14E+08 1.98E+08
萜类 Terpene 1 1.19E+05 7.56E+04
有机酸 Organic acids 27 1.41E+08 1.73E+08
脂质 Lipid 68 8.66E+08 6.01E+08
其他 Others 44 7.63E+07 7.22E+07
由表3可见,香瓜茄果实中共鉴定出类黄酮二级代谢产物9类,分别为异黄酮、黄烷醇类、黄酮碳糖苷、黄酮醇、黄酮、花青素、二氢黄酮醇、二氢黄酮、查耳酮,其中黄酮醇总物质含量最高,二氢黄酮、黄烷醇类、异黄酮含量在LOF中高于SRF,其他则在SRF中含量较高;鉴定出三级代谢产物41种,其中具有显著差异的代谢物共21种,VIP值均大于1。
Tab.3 Flavonoids in SRF and LOF of pepino cultivars

表3 不同香瓜茄栽培种果实中类黄酮化合物组分和含量

编码
Code		 化合物
Chemical compound		 二级代谢产物
Secondary
metabolites		 相对含量
Relative content		 VIP
LOF SRF
pmp000550 毛蕊黄酮苷 异黄酮 2.65E+04 1.69E+04
mws0024 没食子酸 黄烷醇类 8.42E+03 1.22E+04
mws0034 表没食子儿茶素没食子酸酯* 9.89E+03 4.91E+03 1.24E+00
mws0351 没食子儿茶没食子酸酯 1.12E+04 5.94E+03
mws2220 没食子儿茶素没食子酸酯* 1.44E+04 7.15E+03 1.16E+00
mws2221 儿茶素没食子酸酯* 6.18E+03 2.03E+03 1.36E+00
pme0309 没食子酸甲酯 3.64E+03 3.05E+03
pmb0618 8-C-己糖基-橙皮素 O-己糖苷* 黄酮碳糖苷 2.94E+03 1.71E+04 1.14E+00
pmb0645 6-C-己糖基-橙皮素 O-己糖苷 2.70E+04 2.53E+05
pmb0647 8-C-己糖基-木犀草素 O-戊糖苷* 7.75E+02 9.99E+03 1.30E+00
pmp000410 葛根素芹菜糖苷* 1.51E+03 6.62E+03 1.27E+00
mws0059 芦丁* 黄酮醇 1.19E+04 8.06E+05 1.15E+00
mws1329 槲皮素-7-O-葡萄糖苷* 5.18E+04 1.42E+05 1.11E+00
mws4183 槲皮素-3-O-Alpha-L-吡喃阿拉伯糖苷 7.91E+02 2.28E+03
pmb3894 3,7-二氧-甲基槲皮素* 5.43E+06 3.08E+05 1.35E+00
pme1540 异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷 2.76E+03 2.91E+04
pme3211 异槲皮甙* 5.40E+04 1.69E+05 1.19E+00
pmn001583 槲皮素-3-O-刺槐甙* 1.47E+04 1.00E+06 1.16E+00
pmn001642 山柰酚3-O-β-(2″-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸) 5.27E+06 3.55E+06
pmp001309 6-羟基山柰酚-7-O-葡萄糖苷* 1.05E+04 1.78E+06 1.21E+00
pmp001310 6-羟基山柰酚-3,6-O-二葡萄糖苷* 1.04E+05 2.15E+07 1.21E+00
pmp001312 6-羟基山柰酚-3,7,6-O-三葡萄糖苷* 1.89E+03 3.67E+04 1.10E+00
pmp001314 6-羟基山柰酚-3-O-芸香糖-6-O-葡萄糖苷* 9.32E+02 8.01E+04 1.17E+00
mws0043 川陈皮素 黄酮 3.12E+04 2.74E+04
pmb0588 木犀草素 3',7-二氧葡萄糖苷* 4.28E+03 3.11E+04 1.22E+00
pmb0665 木犀草素 8-C-己糖苷-O-己糖苷* 2.28E+03 8.99E+04 1.12E+00
pmb0725 麦黄酮 7-O-阿魏酰己糖苷 2.44E+04 1.13E+05
pmb1108 木犀草素 6-C-己糖基 8-C-己糖基-O-己糖苷 1.65E+03 3.04E+03
pmb2968 金圣草黄素 C-己糖基-O-己糖苷 8.05E+03 7.79E+03
pmp000001 高车前素* 5.98E+02 1.99E+03 1.06E+00
pmp000593 木犀草素-7-O-芸香糖苷 3.75E+04 6.81E+03
mws0170 氯化矢车菊素,氯化氰定 花青素 1.27E+03 1.09E+04
pmb2957 矢车菊素 O-丁香酸 1.83E+05 3.08E+05
mws0914 短叶松素 二氢黄酮醇 7.54E+02 2.68E+04
pmb2979 橙皮素 O-丙二酰基己糖苷* 2.36E+04 1.03E+05 1.07E+00
mws0064 圣草酚* 二氢黄酮 6.23E+04 3.97E+03 1.26E+00
mws1033 高圣草酚* 8.87E+03 3.07E+03 1.01E+00
pme0376 柚皮素 5.71E+02 2.66E+04
pmp001075 橙皮素 查尔酮 5.29E+02 9.76E+03
mws1140 4,2',4',6'-四羟基查尔酮 8.49E+02 2.81E+04
pme2960 柚皮苷查尔酮 8.03E+02 7.36E+04
注:差异显著的基因右上角用*表示;差异基因界定为VIP>1。
Note: Significantly different genes are indicated by * in the upper right corner; Significantly different genes are defined as VIP>1.

2.2 转录组分析香瓜茄果实类黄酮代谢通路基因表达差异

2.2.1 香瓜茄果实转录组测序组装及注释

经质量评估共获得24.96 Gb Clean Data,各样品Clean Data均达到2 Gb,Q30碱基百分比在94%及以上。Clean Date经过组装后共获得114 278个Unigenes,其中Unigene片段不小于2 000的有30 235条。所有Unigenes经过非冗余蛋白数据库注释NR,蛋白质序列数据库注释Swiss-prot等不同数据库比对,其中,Trembl和NR数据库注释到相关信息最多,分别注释到86 353,83 408条(表4)。
Tab.4 Annotated genes in different databases

表4 香瓜茄果实转录组组装与注释信息

数据库
Database		 基因数量
Number of
genes		 百分比/%
Percentage
Total Unigenes 114 278 100.00
Annotated in at least one Database 87 150 76.26
Trembl 86 353 75.56
NR 83 408 72.99
GO 67 221 58.82
KEGG 65 017 56.89
Pfam 58 299 51.02
Swiss-prot 54 652 47.82
KOG 48 878 42.77

2.2.2 不同香瓜茄栽培种果实总体差异基因表达及功能分析

根据差异表达基因(Differentially expressed gene,DEG),测定不同香瓜茄栽培种中基因的表达变化,共有4 645个DEG,其中3 124个基因上调,1 521个差异基因下调(图1)。
Fig.1 Volcano map of differential genes in different pepino

图1 不同香瓜茄栽培种果实中差异基因火山图

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为了研究2种香瓜茄栽培种中的DEG,在RNA-seq中,将DEG进行KEGG Pathway富集分析。根据图2富集结果表明,富集到代谢途径和次生代谢物的生物合成的DEG数量最丰富且显著富集,其次是信号转导机制、细胞内运输、分泌和囊泡转运等。
Fig.2 Scatter plot of KEGG enrichment of DEG between two pepino cultivars
The enrichment degree of KEGG is measured by rich factor enrichment factor(the ratio of the number of differentially-expressed genes enriched in the pathway to the number of annotation genes),q value and the number of genes enriched in this pathway.The larger the rich factor,the greater the degree of enrichment.The smaller q value,the more significant enrichment.We selected the 20 path entries with the most significant enrichment to show in the figure.

图2 不同香瓜茄栽培种果实DEG的KEGG富集散点图

KEGG富集程度通过富集因子(该pathway中富集到的差异基因个数与注释基因个数的比值)、q值和富集到此通路上的基因个数来衡量。富集因子越大,表示富集的程度越大。q值越小,富集越显著。挑选富集最显著的20条pathway条目在该图中进行展示。

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DEG进行GO功能富集分析,由图3可见,DEG在生物过程(Biological process,BP)、细胞组分(Cellular component,CC)和分子功能(Molecular function,MF)三大类上均有所富集。生物过程这个功能分类上富集的DEG数目是最多的,并且大多数DEG集中在代谢过程、细胞进程、生物调节等与代谢成分相关的功能。本研究结合代谢组,重点分析了2个香瓜茄品种类黄酮代谢通路中的基因表达差异。
Fig.3 GO secondary classification histogram of DEG in two pepino cultivars

图3 不同香瓜茄栽培种果实中DEG的GO二级分类柱状图

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2.2.3 不同香瓜茄栽培种果实类黄酮代谢关键基因表达分析

所有注释到的基因簇信息中,进一步检索共获得类黄酮合成相关酶基因503条,其中黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、肉桂醇脱氢酶(CAD)、查尔酮异构酶(CHI)、花青素还原酶(ANR)分别含有43,39,33,20条家族基因。黄酮合酶(FNS)仅有1条(图4)。
Fig.4 Genes number of flavonoid synthesis-related enzymes

图4 类黄酮合成酶相关基因个数

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由图5可见,类黄酮代谢通路中大多数基因表达量在LOF和SRF中差异不明显。其中,类黄酮代谢通路中的上游合成基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)的表达量LOF较SRF均上调;但肉桂醇脱氢酶(CAD)及黄酮醇合成酶(FLS;编号Cluster-1244.16101和Cluster-1244.16099)相关合成基因的表达量SRF明显高于LOF。
Fig.5 Combined analysis of flavonoid metabolites and key genes of metabolic pathways in fruits of different pepino cultivars
The column chart next to each metabolite shows the increase or decrease of metabolites in the fruits of two pepino cultivars;each box represents the expression difference of related genes based on different pepino cultivars.

图5 不同香瓜茄栽培种果实类黄酮代谢物及代谢通路关键基因联合分析

每个代谢物旁边的柱形图表明代谢物在2个香瓜茄栽培种果实中增加或减少的水平;每个方块代表了基于不同香瓜茄栽培种中相关基因的表达差异。

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2.3 转录组和代谢组联合分析不同香瓜茄栽培种果实类黄酮代谢差异

类黄酮代谢起始于苯丙氨酸(图5),苯丙氨酸含量与PAL酶相关基因的表达量变化趋势一致,均是LOF中含量高于SRF。苯丙氨酸代谢产物肉桂酸含量LOF高于SRF。下一步代谢产物对香豆酸在不同酶的作用下分别形成木质素、新绿原酸、反式阿魏酸及柚皮苷查尔酮,其中新绿原酸、反式阿魏酸的含量LOF相对于SRF下调。CAD作为木质素的相关合成酶,其相关基因的表达量均是SRF高于LOF。CAD含量与4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)下游相关基因CHS、柚皮苷查尔酮及相关代谢物新绿原酸、反式阿魏酸含量呈现正相关。CHS下游合成物质柚皮苷查尔酮的含量SRF中大于LOF。FLS基因表达量SRF大于LOF,并且槲皮素的相关物质如异槲皮甙、槲皮素-3-O-刺槐甙、槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量在SRF中均高于LOF。除此之外,FLS和UFGT相关基因介导合成的芦丁含量在SRF中含量明显高于LOF,相对于SRF,在LOF中含量较少。总体看黄酮醇支路,SRF相关代谢物含量相较于LOF表达量均上调,与前述一致。DFR基因的表达量在LOF中大于SRF,其后合成的儿茶素含量未检测出,但与其相关的儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯LOF均大于SRF。

2.4 差异表达基因qRT-PCR分析

挑选在香瓜茄转录组测序中FPKM值差异表达的4个参与类黄酮合成的酶进行qRT-PCR试验。结果表明(表5、图6),4个参与类黄酮合成的基因在不同栽培类型的LOF和SRF中的上下调表达趋势与转录组FPKM值结果一致。其中,PAL、F3H在LOF中表达量最高;FLS、CAD在SRF中的表达量更高。
Tab.5 qRT-PCR analysis of 4 differential expressed genes in two pepino cultivars

表5 荧光定量PCR分析香瓜茄中4个差异表达基因

基因
Genes		 编码ID
Code ID		 转录组测序表达量(FPKM)
Transcriptome sequencing expression
LOF SRF
PAL Cluster-1244.24547 34.53 8.21
PAL Cluster-1244.48177 20.86 2.62
F3H Cluster-1244.48397 263.16 85.37
FLS Cluster-1244.16099 2.37 7.98
CAD Cluster-1244.3348 0.46 5.38
CAD Cluster-2666.0 0.00 7.57
Fig.6 The expression of 4 differential genes in different cultivars of pepino
Different lowercase letters show significant difference(P<0.05).

图6 4个差异基因在不同栽培种香瓜茄中的表达

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

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3 结论与讨论

类黄酮代谢始于苯丙氨酸[14⇓⇓-17],已被证实有抗氧化、抗病毒的功效[18],较为常见的芦丁、柚皮素查尔酮、绿原酸、圣草酚及二氢槲皮素等类黄酮物质在番茄[19]、马铃薯[20]、烟草[21]等茄科作物中的研究已经较为透彻。本研究综合代谢组和转录组数据分析2种不同香瓜茄栽培种间类黄酮代谢通路,对2种香瓜茄果实中的类黄酮差异代谢物及差异基因进行了解析。
苯丙氨酸除了是蛋白质的重要成分外,还是众多芳香族初级和次级代谢产物的前体,具有广泛的生理功能,并且动物缺乏合成苯丙氨酸的能力,只能依靠食物供应[22-23]。因此,香瓜茄中的苯丙氨酸可以作为人体中苯丙氨酸的重要来源。LOF中含量较高,推测LOF具有更高的抗氧化作用。苯丙氨酸解氨酶是苯丙氨酸脱氨的第一步反应,可以调节植物生长,对各种抗逆反应有着重要作用[24-25]。苯丙氨酸脱氨之后形成数种多酚化合物的前体,包括木质素、类黄酮、肉桂酸酯等。研究结果表明,苯丙氨酸代谢产物肉桂酸及下一步代谢物质4-香豆酸含量均在LOF中高于SRF。肉桂酸具有抗氧化、抗菌、抗癌、神经保护、抗炎和抗糖尿病等特性[26],这与前人研究的香瓜茄特性相吻合。除此之外,肉桂酸是芳香族化合物,香瓜茄的特殊香味物质可能也与肉桂酸的含量有关[27]。木质素是一种酚类杂聚物,沉积在二次增厚的细胞壁中,可提供机械强度[28]。4-香豆酸通过CAD和CHS分别合成木质素、柚皮苷查尔酮、新绿原酸和反式阿魏酸。转录组差异分析结果显示,CAD相关DEG均在SRF中高于LOF,猜测CAD下游合成物质木质素含量SRF中大于LOF。4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)在许多植物物种中与木质素含量呈正相关[29],本研究中,4CL并未检测到其表达量,但与其下游相关基因CHS、柚皮苷查尔酮及相关代谢物新绿原酸、反式阿魏酸含量呈现显著正相关,与前人研究较符合,香瓜茄中4CL与木质素含量的调控机制有待进一步研究。
F3H是一种关键的结构基因,它作用于类黄酮生物合成途径的分叉处,产生2个分支[30]。在F3'H的作用下形成圣草酚,F3'H作为类黄酮通路中重要的上游核心基因,其表达水平决定了类黄酮物质含量[31]。其下游分枝调控基因FLS和DFR酶之间存在底物竞争,分别产生黄酮醇和花青素。在石榴花中,较高的黄酮醇生物合成需要增加FLS基因的表达,导致DFR基因的表达减少[32]。本研究中FLS基因表达量SRF大于LOF,并且槲皮素的相关物质如异槲皮甙、槲皮素-3-O-刺槐甙、芦丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量在SRF中均高于LOF,香瓜茄中高的黄酮醇含量与前人报道一致[9]。DFR的表达量在LOF中大于SRF,其后合成的儿茶素含量未检测出,但与其相关的儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯LOF均大于SRF。
综上,本研究明晰了2种香瓜茄栽培种间类黄酮相关化合物的差异,相较于LOF,SRF中类黄酮相关化合物总体来看含量较高。对下一步评价香瓜茄不同资源中营养成分、品质分析及功能研究等具有重要作用。为利用这些资源开展杂交育种,丰富香瓜茄种质资源类型,创制具有更高营养价值的香瓜茄奠定了基础。

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