Genome-Wide Identification and Expression Profile Analysis of DUF760 Gene Family in Rice

Qiang DU, Lingling HAN, Xiuwen XIAO, Jincheng LI, Mengyu SHEN, Zhilong WANG, Qiuhong CHEN

Acta Agric Boreali Sin ›› 2023, Vol. 38 ›› Issue (1) : 1-8. DOI: 10.7668/hbnxb.20193226
Crop Genetics & Breeding·Germplasm Resources·Biotechnology

Genome-Wide Identification and Expression Profile Analysis of DUF760 Gene Family in Rice

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Abstract

To investigate the potential functions of DUF760s in rice growth and development,the genome-wide identification,classification,promoter sequence and expression profile analysis of the DUF760 gene family were performed.This research identified 6 and 8 members of DUF760 gene family in rice and Arabidopsis respectively by bioinformatics analysis.Phylogenetic tree analysis divided these members into two subfamilies,there were also some characteristic differences between the two subfamilies in protein conserved motif and gene structure.Multiple cis-acting elements responding to stresses and phytohormones existed in the promoter regions of rice DUF760 family genes.ABRE(abscisic acid response)element was present in the promoter sequence of all DUF760 family members,the promoter region of OsDUF760-1 possessed 9 abscisic acid(ABA)related response elements.The transcriptional expression level of OsDUF760-1 in rice was significantly down-regulated after ABA treatment,while OsDUF760-3 was significantly up-regulated.The expression change patterns of these two genes in rice after drought stress treatment were consistent with that after ABA treatment,which indicated that these two genes may participate in rice drought stress response through ABA signaling pathway,and play different roles.In addition to strong responses to ABA and drought stress treatments,members of rice DUF760 family also showed relatively strong expression changes in response to JA(Jasmonic acid),low temperature and M.oryzae treatments.

Key words

Rice / DUF760 gene family / Stress / Phytohormone / Expression profile analysis

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Qiang DU , Lingling HAN , Xiuwen XIAO , Jincheng LI , Mengyu SHEN , Zhilong WANG , Qiuhong CHEN. Genome-Wide Identification and Expression Profile Analysis of DUF760 Gene Family in Rice. Acta Agriculturae Boreali-Sinica. 2023, 38(1): 1-8 https://doi.org/10.7668/hbnxb.20193226
随着基因组测序技术的不断发展,蛋白数据库中的序列也在快速增长。在UniProt数据库中已经有超过六千万的蛋白序列,而且还在以每个月2%的速度增长[1]。在进行序列注释时,大约有三分之二的蛋白序列是通过与先前注释的蛋白序列同源而被鉴定和注释,而剩余的蛋白序列则被命名为假想蛋白或者功能未鉴定蛋白[2-3]。Pfam数据库将其数据库中的蛋白按照蛋白功能结构域分成大量的蛋白家族。在Pfam 29.0版本中,包含有16 295个蛋白家族。其中,有3 892个家族被注释为未知功能结构域(Domain of Unknown Function,DUF)家族[4-5],即注释时这些家族成员的功能未被鉴定。近年来,在DUF家族中某个成员功能被试验证实后,这个DUF蛋白家族就会被重新命名[6]。1998年,DUF1和DUF2结构域蛋白首次被命名,并被添加到SMART数据库,随后它们的功能被鉴定,从而重新被命名为GGDEF和EAL结构域蛋白[5,7]。在Pfam数据库中,DUF家族通常使用前缀DUF加上一个数字来命名,例如DUF1618或DUF668[8-9]。有些DUF家族分布广泛,而有些家族仅在细菌或者某些真核生物中被发现[10]。科研人员利用全面的基因组分析技术,综合理解了一些DUF家族的起源、进化和可能的生物学功能,例如拟南芥中DUF231、DUF581、DUF724和DUF1117等家族的相关分析已被报道[11-14]
近年来,水稻中一些DUF蛋白的功能陆续被鉴定出来。水稻中拥有DUF1645和DUF4005结构域的蛋白影响籽粒粒型[15-16];OsSIDP366编码一个带有DUF1644结构域的蛋白,正向调控水稻干旱和盐胁迫的响应[17];OsDSR2编码一个DUF966结构域的蛋白,调控水稻对ABA的敏感性[18];盐处理诱导一个包含DUF662结构域水稻基因的表达,从而改变水稻的耐盐性[19]。这些结果表明,含有DUF结构域的蛋白对于水稻的生长发育和抗逆性具有重要作用。但目前水稻中还有许多DUF蛋白家族没有被鉴定及被研究生物学功能,其中有关水稻DUF760家族基因的报道还未发现。本研究在水稻全基因组范围鉴定了6个DUF760基因家族成员。转录表达谱分析结果表明,水稻DUF760(OsDUF760)家族基因可能在胁迫和植物激素响应中扮演重要的调控角色,可为揭示OsDUF760基因的功能提供重要理论支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

用于DUF760基因家族成员转录表达谱检测的所有水稻材料品种为日本晴。在抽穗期,分别采集水稻的根(Root)、茎(Stem)、叶片(Leaf)、叶鞘(Sheath)、幼穗(Panicle)等组织样品,用于DUF760基因家族成员的组织转录表达谱检测。

1.2 DUF760家族成员鉴定与蛋白理化性质分析

本研究使用到的水稻(v7.0)和拟南芥(v10.0)参考基因组序列源自Phytozome数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。DUF760保守结构域序列(No.PF05542)从Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)下载,DUF760家族成员通过HMMER 3.2.1(http://hmmer.org/)软件完成鉴定,DUF760家族成员是否冗余通过Pfam数据库完成核实。DUF760蛋白的理化性质分析利用ProtParam tools(http://web.expasy.org/protparam/)完成。

1.3 系统进化树、基因结构和蛋白保守基序分析

氨基酸序列多重比对通过MEGA 7.0的ClustalW软件完成,系统进化树构建通过近邻法完成,可视化利用FigTree(v1.4.4)工具完成。蛋白保守基序通过在线工具MEME(http://meme-suite.org/meme/)检索,可视化利用TBtools工具完成。基因结构分析通过GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/)在线工具完成。

1.4 启动子顺式作用元件分析

将起始密码子ATG上游1 500 bp的基因组序列设置为基因的启动子序列。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线工具对水稻DUF760(OsDUF760)家族成员的启动子序列进行顺式作用元件分析,将与逆境响应、激素响应、转录相关的元件进行分析和统计。

1.5 胁迫及激素处理方法

所有的处理试验均采用在光照培养箱(28 ℃,14 h光照/25 ℃,10 h黑暗)中的水稻营养液中长至三叶一心期的水稻幼苗来完成。激素处理:将三叶一心期水稻幼苗分别转移至加入了CK(25 μmol/L)、IAA(50 μmol/L)、GA(100 μmol/L)、ABA(100 μmol/L)、JA(100 μmol/L)的水稻营养液中,在光照培养箱(28 ℃,14 h光照/ 25 ℃,10 h黑暗)中完成处理试验,将不添加激素的水稻营养液中幼苗设为对照。非生物胁迫处理:将水稻幼苗分别移至4 ℃培养箱(低温处理)和含有20% PEG的营养液中(干旱处理)进行。除温度条件改变外,低温处理时的培养条件与之前的培养条件一致;除在水稻营养液中增加PEG外,干旱处理时的培养条件与之前的培养条件一致,将处于正常生长条件的水稻幼苗设为对照。所有的激素和非生物胁迫处理均分别于处理0,1,3,6,12 h取水稻叶片组织样品,用于OsDUF760基因的转录表达谱分析。生物胁迫处理:将浓度为1×105/mL的稻瘟菌孢子溶液(生理小种为RO1-1)喷施接种三叶一心期的水稻幼苗,喷施蒸馏水的水稻幼苗设为对照,后将水稻幼苗进行遮光黑暗处理24 h,之后放入湿度为100%的光照培养箱(28 ℃,14 h光照/25 ℃,10 h黑暗)中继续生长,分别于接种0,1,2,3,4 d取水稻叶片组织样品,用于OsDUF760基因的转录表达谱分析。每个样本组织均取自3个随机单株。所有处理试验均设置3次生物学重复。

1.6 总RNA的提取和qRT-PCR扩增

使用TRIzol试剂(Invitrogen,15596018)提取水稻组织样本的总RNA,利用逆转录试剂盒(Thermo Scientific,K1682)将2 μg总RNA逆转录合成第一链cDNA。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)在ABI公司的Stepone实时荧光定量PCR仪上完成,采用的荧光染料为2×SYBR(TaKaRa,RR420A)。qRT-PCR反应体系为10 μL,qRT-PCR反应程序:95 ℃预变性1 min;95 ℃变性5 s,60 ℃延伸30 s,40个循环。内参基因为水稻Ubquitin,以2-ΔΔCT方式计算目的基因的相对表达量。OsDUF760基因及Ubquitin的qRT-PCR扩增引物(表1)。将基因的相对表达量取以2为底数的对数构建热图。在激素及各种胁迫处理表达分析中,通过SPSS进行差异显著性分析。
Tab.1 Primers used for relative expression level detection of OsDUF760 family members

表1 OsDUF760家族成员相对表达量检测所用引物

基因名称
Gene name
引物序列(5'—3')
Primer sequence (5'—3')
OsDUF760-1 F: CCGGCCAAGATAACTGTATTTG
R: CCAACAATAGTCAGGTTGCAAA
OsDUF760-2 F: CTACATCCGAGGTCTTGAGTAC
R: TCTTTCTGAGGAGAAATGCAGT
OsDUF760-3 F: AAACGAATTTCTCCTGGCTCTA
R: GAACTAACAGCTGCACATTAGG
OsDUF760-4 F: GCATGTATTGTTAGTCGCACAA
R: AAATGCATCCTCCACTAGAACA
OsDUF760-5 F: CTGATTCTTGCTCAGTCACAAG
R: GGATCAAAGCCCATCATGTAAC
OsDUF760-6 F: CAGCCCCTGATATCTATTCCTC
R: GGAGATCATGAATGTGCATCAC
Ubiquitin F: AACCAGCTGAGGCCCAAGA
R: ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA

2 结果与分析

2.1 DUF760基因家族成员鉴定和蛋白理化性质分析

通过在水稻全基因组范围内搜索和分析,共发现6个编码含DUF760保守结构域的基因;以同样的方法在拟南芥中发现8个编码含DUF760保守结构域的基因,根据它们在染色体的位置,分别命名为OsDUF760-1~OsDUF760-6AtDUF760-1~AtDUF760-8(表2)。水稻中DUF760家族基因的编码序列长度为1 011~1 368 bp,编码蛋白的长度为336~455个氨基酸,蛋白等电点为4.94~9.24,蛋白分子量为36.931~49.956 ku。OsDUF760家族成员分布在第2,3,4,11,12染色体上,其中第3染色体有2个成员。拟南芥DUF760家族基因的编码序列长度为1 023~1 272 bp,编码340~423个氨基酸长度的蛋白,蛋白等电点为5.04~9.20,蛋白分子量为37.955~47.189 ku,AtDUF760家族成员分布在拟南芥第1,2,3,5染色体上。
Tab.2 Information of DUF760 family members in rice and arabidopsis

表2 水稻和拟南芥DUF760家族成员信息

基因名称
Gene name
基因序列号
Gene locus ID
编码序列长度/bp
CDS length
氨基酸长度/aa
Amino acid length
等电点
pI
分子量/ku
MW
OsDUF760-1 Os02g0833400 1 011 336 6.58 36.931
OsDUF760-2 Os03g0607500 1 218 405 4.94 44.787
OsDUF760-3 Os03g0717900 1 368 455 9.24 49.956
OsDUF760-4 Os04g0596300 1 218 405 5.51 45.306
OsDUF760-5 Os11g0456100 1 167 388 8.28 44.084
OsDUF760-6 Os12g0581700 1 182 393 5.10 43.185
AtDUF760-1 At1g32160 1 221 406 5.54 45.868
AtDUF760-2 At1g48450 1 272 423 5.86 47.189
AtDUF760-3 At1g63610 1 023 340 6.26 37.955
AtDUF760-4 At2g14910 1 161 386 5.04 43.396
AtDUF760-5 At3g07310 1 107 368 8.46 41.368
AtDUF760-6 At3g17800 1 266 421 9.20 46.067
AtDUF760-7 At5g14970 1 068 355 5.57 39.570
AtDUF760-8 At5g48590 1 035 344 7.67 38.959

2.2 DUF760家族成员进化、基因结构和保守基序分析

为进一步了解DUF760家族成员的特征,对水稻和拟南芥DUF760家族成员进行了系统进化树分析、基因结构以及蛋白保守基序分析。图1系统进化树分析结果显示,水稻和拟南芥DUF760家族成员可以明显分为2个亚家族,分别命名为Ⅰ族和Ⅱ族。OsDUF760-3,4,5AtDUF760-1,2,5,6,8属于Ⅰ族,而OsDUF760-1,2,6AtDUF760-3,4,7属于Ⅱ族。图2基因结构分析结果表明,Ⅰ族中的OsDUF760基因拥有3个外显子,而Ⅱ族中的OsDUF760基因拥有6~7个外显子。OsDUF760成员除了在基因结构上的不同,在蛋白的保守基序(Motif)分布上也有不同。图1保守基序分析结果显示,水稻和拟南芥所有家族成员都拥有Motif 1,3,5,Motif 2,4是Ⅰ族特有的基序,Motif 6,8,9,10只存在于Ⅱ族中。
Fig.1 Phylogenetic tree and motif analysis of DUF760 family members

图1 DUF760家族成员的系统进化树和保守基序分析

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Fig.2 Gene structure analysis of DUF760 family members

图2 DUF760家族成员的基因结构分析

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2.3 OsDUF760家族成员的顺式作用元件分析

启动子中的顺式作用元件可为基因在不同组织或环境胁迫中的表达模式及基因功能探索提供一些线索[20]。以往研究发现,各类响应表达的基因与这些基因上游启动子区域的顺式作用元件有显著的相关性[21-22]。对水稻DUF760基因的启动子区域进行顺式作用元件分析,共筛选到14个与非生物胁迫响应、植物激素响应和转录因子相关的顺式作用元件(图3)。其中,植物激素响应相关的顺式作用元件数量最多,主要涉及ABA(脱落酸)、JA(茉莉素)、SA(水杨酸)、IAA(生长素)和GA(赤霉素)。其中ABRE(ABA响应)元件在家族所有成员的启动子中存在,CGTCA-motif和TGACG-motif(JA响应)元件在4个家族成员的启动子中存在。非生物胁迫响应有关的顺式作用元件包括与低温(LTR和DRE core)和干旱(MBS)响应有关的元件。CCAAT-box是一个与MYB转录因子相关的顺式作用元件,其存在于OsDUF760-1,3,6基因启动子中,在OsDUF760-1启动子中有3个拷贝。OsDUF760-1启动子区域还拥有数量最多的与激素相关的顺式作用元件,其中ABA响应相关的元件有9个,这说明OsDUF760-1极有可能参与调控各类激素信号途径;在6个成员中,OsDUF760-5OsDUF760-3拥有数量相对最少的与激素相关的顺式作用元件。
Fig.3 Cis-acting elements identification in promoters of OsDUF760 family genes

图3 OsDUF760家族基因启动子中的顺式作用元件鉴定

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2.4 OsDUF760基因的表达谱分析

2.4.1 组织表达谱分析

为进一步了解基因潜在的生物学功能,对水稻DUF760家族成员在水稻不同组织部位进行了转录表达水平分析。如图4所示,各基因表达谱聚类分析结果表明,OsDUF760-6与其他成员在组织表达模式上有明显差别,OsDUF760-2OsDUF760-3OsDUF760-1OsDUF760-4两两之间有着极其相似的组织表达模式。
Fig.4 Tissue expression profile analysis of OsDUF760 family genes

图4 OsDUF760家族基因的组织表达谱分析

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OsDUF760-6在根和叶片中表达水平相对较高,在茎中表达水平较低。OsDUF760-1,2,3,4,5均在叶片中表达水平相对最高,在根和茎中表达水平较低。OsDUF760-1,4,5在穗中均有相对较高水平的表达。

2.4.2 激素处理响应表达谱分析

图5结果所示,在ABA处理水稻后,OsDUF760家族成员在水稻中呈现出2种表达变化模式。OsDUF760-3,4,6表达量上调,其他3个成员表达量下调。OsDUF760-3在处理6 h表达量显著上调;而OsDUF760-1在处理6 h表达量显著下调。除了OsDUF760-1,3以外,其他基因的表达水平对ABA处理的响应变化未达到显著水平。在JA处理后,OsDUF760-1,2,5,6表达量呈现下降趋势;而另2个成员的表达量呈现上升趋势。处理6 h,OsDUF760-1表达水平显著下调,而OsDUF760-3表达水平显著上调。OsDUF760家族所有成员的表达水平对GA、CK和IAA处理的响应变化幅度相对较小,均未达到显著水平。
Fig.5 Expression profile analysis of OsDUF760 family genes in response to hormone treatments
Different lowercase letters showed significantly difference(P<0.05).The same as Fig.6,7.

图5 OsDUF760家族基因的激素响应表达谱分析

不同小写字母表示有显著差异(P<0.05)。图6,7同。

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2.4.3 胁迫响应表达谱分析

在自然条件下,所有植物都可能遭遇各种生物和非生物胁迫,为了解OsDUF760家族基因在水稻逆境响应中的潜在功能,对水稻分别进行了干旱、低温和稻瘟病菌接种3种胁迫处理,检测处理前后水稻中OsDUF760家族成员的转录表达水平。如图6所示,干旱处理1 h,OsDUF760家族所有成员的表达水平与处理前无显著变化,随着处理时间的进一步延长,OsDUF760-1,2,5表达水平出现了显著下调;而OsDUF760-3,4,6表达水平显著上升。同样,低温处理1 h,OsDUF760家族所有成员的表达水平与处理前差异不显著,但随着低温处理时间的延长,OsDUF760-2,4,6表达水平呈现持续上升趋势,而其他3个成员的表达水平无显著变化。如图7所示,在稻瘟病菌接种处理水稻幼苗时,OsDUF760-3,4在处理2 d后表达水平显著上升,OsDUF760-2,5则表达水平显著下降。OsDUF760-1,6表达水平无显著变化。
Fig.6 Expression profile analysis of OsDUF760 family genes in response to abiotic stresses

图6 OsDUF760家族基因的胁迫响应表达谱分析

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Fig.7 Expression profile analysis of OsDUF760 family genes in response to biotic stress

图7 OsDUF760家族基因的生物胁迫响应表达谱分析

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3 结论与讨论

本研究通过对水稻进行全基因组分析,共鉴定了6个OsDUF760基因家族成员,而拟南芥全基因组包含8个AtDUF760基因家族成员。系统进化树分析将水稻和拟南芥DUF760家族成员分成2个亚家族,这2个亚家族在成员基因结构和蛋白保守基序特征上也具有一定的差异性。组织表达谱检测结果显示,OsDUF760基因家族成员在水稻植株的各个部位都有转录表达,且OsDUF760-2OsDUF760-3OsDUF760-1OsDUF760-4两者之间有着极其相似的组织表达模式,说明这些基因可能在水稻的组织生长发育过程中发挥冗余或者协作的功能。由于OsDUF760-6与其他成员在组织表达模式上有着明显差异,推测其相对于其他成员具有自身独特的功能特征。
启动子顺式作用元件分析显示,激素响应、非生物胁迫响应和转录因子相关的顺式作用元件广泛存在于OsDUF760成员的启动子区域,尤其是以植物激素响应相关的顺式作用元件数量最多,暗示OsDUF760成员可能参与相关途径的调控过程。其中ABRE(ABA响应)元件在OsDUF760家族所有成员的启动子中存在,说明OsDUF760家族成员可能与ABA信号通路存在某种关联。OsDUF760-1启动子区域拥有数量最多的与激素相关的顺式作用元件,其中ABA响应相关的元件有9个,推测OsDUF760-1可能在ABA合成或者信号转导途径中发挥举足轻重的作用。激素处理响应表达谱检测结果亦表明,在ABA处理水稻后,OsDUF760-1的转录表达水平表现出明显下调的趋势;而OsDUF760-3表现出明显上调的趋势。除对ABA处理有较强的响应表达变化外,OsDUF760-1,3对JA处理亦有较强烈的响应表达变化,并且各自的变化趋势与ABA处理的变化趋势一致。
在水稻遭遇干旱胁迫时,OsDUF760所有成员都有明显的响应表达变化,表明OsDUF760基因家族可能在水稻响应干旱胁迫时具有重要作用。前人研究表明,ABA信号通路在植物遭遇干旱胁迫时发挥重要功能,干旱胁迫会诱导植物体内ABA的累积,进而关闭气孔并减少水分蒸腾[23]OsDUF760-1在干旱胁迫和ABA处理水稻时都表现出相似的下调表达模式,而OsDUF760-3在这2种处理时表现出一致的上调表达响应,说明这2个基因可能在水稻面临干旱胁迫时扮演不同的角色。在水稻遭遇低温胁迫时,OsDUF760-2,4,6受到了明显的诱导表达,而另外3个成员的表达水平无明显变化,说明OsDUF760-2,4,6可能在水稻的耐冷方面发挥一定的功能。在稻瘟菌接种处理水稻时,OsDUF760-4的表达水平显著上升,而OsDUF760-5的表达水平显著下降,表明这些基因可能参与水稻稻瘟病抗性防御反应。
本研究对水稻DUF760家族成员进行了详细和多层次的分析,在水稻不同的组织部位、不同的逆境和植物激素处理水稻时,该家族各成员表现出相似或不同的表达模式,暗示该家族成员在水稻生长发育和抵抗各种胁迫时可能的重要性,为深入探索该家族各成员的生物学功能提供了重要线索。

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