栏目: 植物保护 http://journals.caass.org.cn/zgnykx zh-cn http://journals.caass.org.cn/zgnykx/CN/current.shtml http://journals.caass.org.cn/zgnykx 5 http://journals.caass.org.cn/zgnykx/CN/abstract/abstract56969.shtml 【目的】 通过构建柑橘大实蝇（Bactrocera minax）BminOBP6的C末端截短突变体（TOBP6），比较野生型BminOBP6和突变体TOBP6对气味配体的结合能力，检测在不同pH条件下二者对气味配体结合能力的差异，为揭示BminOBP6与配体的互作机制提供参考。【方法】 通过在线工具SWISS MODEL对BminOBP6进行同源建模，根据构建的3D模型确定将被切除的BminOBP6第6个α螺旋（α6）之后的C末端序列；设计特异性引物扩增BminOBP6的C末端截短突变体（TOBP6）的编码序列，即TOBP6；构建重组表达载体pET32a/TOBP6，将此重组载体与实验室保存的重组载体pET32a/BminOBP6分别转入原核细胞BL21（DE3）中，异源表达野生型BminOBP6及其突变体TOBP6；以1-NPN为荧光探针进行荧光竞争结合试验，检测BminOBP6和TOBP6在两种pH环境（pH 7.4和pH 5.0）下对1-十一醇和(+)-柠檬烯的结合能力。【结果】 序列比对结果显示，BminOBP6与致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）CquiOBP1的序列具有很高的相似性，为62.6%，远高于30%，因此选择以CquiOBP1的3D结构作为BminOBP6同源建模模板。模型显示BminOBP6的α6之后是由8个氨基酸残基（D117—P124）组成的C末端序列，即将被切除的C末端序列。在此基础上设计引物克隆获得了编码TOBP6的cDNA序列，并构建了其重组表达载体pET32a/TOBP6，该重组载体和pET-32a/BminOBP6重组载体分别转入大肠杆菌细胞中进行了异源表达。荧光竞争结合试验结果显示，在pH为7.4时，BminOBP6与1-十一醇和(+)-柠檬烯具有很强的结合能力，K_i值分别为6.89和9.50 μmol·L^-1。当pH降至5.0时，BminOBP6却丧失了对1-十一醇的结合能力，同时与(+)-柠檬烯的结合能力也大幅减弱，K_i值从9.50 μmol·L^-1升至31.26 μmol·L^-1；而不论在何种pH条件下，TOBP6均丧失了对这两种气味配体的结合能力。【结论】 pH在柑橘大实蝇 BminOBP6与其配体结合和释放过程中发挥了重要作用，并且BminOBP6的C末端在配体的结合中起着关键作用。

]]> http://journals.caass.org.cn/zgnykx/CN/abstract/abstract56972.shtml 【目的】 明确美国白蛾（Hyphantria cunea）响应槲皮素诱导的差异表达P450基因及系统发育关系，探究美国白蛾P450基因对槲皮素诱导的剂量效应，以及P450基因在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中的作用。【方法】 基于槲皮素诱导的美国白蛾中肠转录组数据，从中筛选显著差异表达的P450基因，应用MEGA X软件对5个P450 基因及其他近缘物种的P450基因进行系统进化关系分析；通过RT-qPCR技术检测5个P450基因在不同槲皮素浓度（0.5%、1.0%、2.0%和4.0%）处理下的表达模式；克隆CYP6ZB2全长cDNA序列，利用RNA干扰（RNAi）技术探明CYP6ZB2基因沉默对美国白蛾体重及存活率的影响。【结果】 从转录组的差异表达基因中筛选到5个显著响应槲皮素诱导的P450基因，经P450命名委员会分别被命名为CYP4G296、CYP4G297、CYP333A30、CYP304F33和CYP6ZB2（GenBank登录号：ON032363—ON032367）。系统发育分析表明，这5个基因被聚类到CYP2、CYP3、CYP4和线粒体CYP进化枝。RT-qPCR结果表明，P450基因响应槲皮素胁迫具有显著的剂量效应，CYP4G297、CYP304F33、CYP333A30和CYP4G296的表达均被不同浓度槲皮素抑制，CYP6ZB2的表达在0.5%—2.0%的槲皮素诱导下显著上调，而在4.0%的槲皮素浓度下被显著抑制。克隆CYP6ZB2的全长cDNA序列，CYP6ZB2具有完整的开放阅读框（ORF），编码500个氨基酸。RNAi结果表明，注射两种剂量（500和1 000 ng）dsCYP6ZB2均可显著抑制CYP6ZB2的表达，注射1 000 ng dsCYP6ZB2 48 h后干扰效率达到最高（96.9%）。CYP6ZB2被干扰的美国白蛾幼虫经0.5%槲皮素处理后体重增长量低于对照组，存活率（53.33%）分别为未处理组的61.5%和注射双蒸水组的72.7%（P<0.05）。【结论】 筛选鉴定到美国白蛾响应槲皮素诱导的5个P450基因，槲皮素对5个基因的诱导表达具有明显的剂量效应，说明不同的P450基因对槲皮素的响应模式存在差异。RNAi能高效沉默CYP6ZB2，0.5%槲皮素对CYP6ZB2被干扰的美国白蛾幼虫的生长发育具有一定抑制作用，表明CYP6ZB2在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中发挥着重要作用。

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